pH响应性可降解聚(醚酯-氨酯)的制备及在药物缓释领域的应用

张冬梅, 张 娜，纪晨旭, 赵海云, 张丹丹, 刘文坤

（1.山东省食品药品检验研究院国家药品监督管理局仿制药研究与评价重点实验室山东省仿制药一致性评价工程技术研究中心，山东济南 250101；2.山东羽时生物科技有限公司，山东济南 250014；3.济南康桥医药科技有限公司，山东济南 250100）

随着医疗技术的进步和发展，关于生物医疗高分子材料的研究受到研究人员的广泛关注[1]。理想的生物医用材料应当具备良好的生物相容性、降解无毒以及易加工成型等性能。这其中，生物可降解聚氨酯在组织支架、外科手术、药物释放载体等生物医疗领域表现出巨大的优势[2-5]。此外，聚氨酯的力学性能优异且易于改性，在其分子结构中引入特殊的功能基团可赋予其额外的物理化学性质[6,7]。

作为药物载体，传统的医用材料多为将药物包裹于材料内部，由于药物与材料之间的作用力有限，这类载药体系往往缺乏靶向作用，在正常生理环境中易出现治疗药物不可控扩散，导致漏释或早释现象，从而引发中毒等不良后果[8]。为了解决这一问题，环境响应型医用材料逐渐受到人们的重视。常见的环境响应材料主要包括有因pH[9]、温度[10]、磁场[11]和光照[12]等条件的变化而引起自身物理化学性质变化的材料。因此，可通过将特定响应基团引入到医疗材料的分子结构中来制备环境响应型生物医用材料。众所周知，人体各组织部位的生理pH 值存在显著差异，特别是肿瘤细胞（pH=4～6）要明显低于正常细胞（pH=7.4），因此，可通过pH 响应材料负载治疗药物以实现对病变部位的靶向释放[13-15]，因此pH 响应材料的设计和制备就成为该领域的研究热点。

本文设计和制备了一种具有pH 响应的可降解聚氨酯材料。首先合成了含吡啶的二醇化合物(PyDH)，然后通过简单的缩聚方法将其引入到聚氨酯中，制备了侧链含吡啶基团的聚(醚酯-氨酯)（PEEU-Py）。对PyDH 和PEEU-Py 的化学结构和理化性能进行了表征和研究。针对其在靶向给药方面的潜在应用，详细研究了PEEU-Py 膜材料的pH敏感溶胀性能和药物释放行为与介质pH 值的关系。并且对材料的细胞毒性进行了测试，进一步对材料作为药物缓释材料做出生物学评价。

1 实验部分

1.1 原料与试剂

聚 乙 二 醇(PEG，Mn=2000)、ε-己 内 酯(ε-CL，99%): Sigma-Aldrich 试剂，使用前均80 ℃真空除水2 h；二月桂酸二丁基锡(DBTDL，95%)、二苯基甲烷二异氰酸酯(MDI，98%)、4-乙烯基吡啶(VP，96%)、3-巯基-1,2 丙二醇(TG，97%):阿拉丁试剂有限公司；N,N-二异丙基乙胺(DIPA，99%): 百灵威科技有限公司；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)：分析纯，天津科密欧试剂有限公司，使用前加CaH2回流后重蒸。

1.2 PEEU-Py 膜的制备

1.2.1 PyDH 的制备：通过巯基与烯烃的点击化学反应制备了PyDH，如Fig.1(a)所示，将VP (5.26 g,0.05 mol)和TG (5.41 g,0.05 mol)溶于10 mL DMF，加入反应瓶中搅拌均匀，再加入DIPA (0.13 g，1.0 mmol)，干燥氩气保护下室温反应5 h。经大量冰乙醚沉降，重复3 次后通过旋转蒸发仪除去乙醚，得淡黄色黏稠液体，产率为94.2%。

1.2.2 聚酯醚PECL 的制备：如Fig.1(b)所示，取除水后的PEG (20 g, 0.010 mol)和ε-CL (20 g, 0.175 mol)于三口瓶中，加入质量分数0.3%的DBTDL 催化剂，在氩气保护下，升温至140 ℃反应20 h。反应后将产物溶于少量氯仿，经6～8 倍冰乙醚沉降、抽滤，此过程重复3 次，常温真空干燥至恒量得到PECL，产率为92.6%。GPC (THF)：Mn=3940,MWD=1.12。

1.2.3 聚氨酯PEEU-Py 的制备：反应方程式如Fig.1(c)所示，投料比例按照Tab.1 进行。将一定量的PECL 和PyDH 溶于5 mL DMF 溶液后加入到装有机械搅拌装置的三口瓶中，再加入MDI 的DMF 溶液(0.25 g/mL)和0.03g 催化剂DBTDL，搅拌均匀后，在氩气保护下，80 ℃油浴反应，至红外检测—NCO 吸收峰(2250～2280 cm-1)完全消失。反应过程中若体系变黏，加少量DMF 稀释，约3 h。反应结束后用DMF 稀释至0.25 g/mL，经8 倍冰乙醚沉降，抽滤，常温下真空干燥至恒量得到聚氨酯PEEU-Py。根据PECL 与PyDH 的摩尔比将产物分别命名为PEEUPy-1/2，PEEU-Py-1/4，PEEU-Py-1/6 和PEEU-Py-1/8。

1.2.4 PEEU-Py 膜材料的制备：将PEEU-Py 用氯仿溶解，得到质量浓度为4.0 g/mL 的溶液，减压除去溶液中的气体，离心后将上清液缓慢注入聚四氟乙烯磨具中，常温自然挥发4 d 后转移至40 ℃真空干燥箱继续干燥3 d，得到透明状的淡黄色膜材料，厚度为(0.35±0.02) mm。

Fig. 1 Synthetic pathway of (a) PyDH, (b) PECL and (c) PEEU-Py

Tab.1 Compositions and molecular weight of the PEEU-Py samples

1.3 测试与表征

1.3.1 化学结构表征：1H-NMR 采用德国Bruker 公司的AVANCE II 型核磁共振波谱仪(400 MHz)，以氘代氯仿为溶剂；IR 采用德国Bruker 公司的Alpha 型傅里叶变换红外光谱仪，扫描范围400～4000 cm-1，分辨率为4 cm-1；渗透凝胶色谱(GPC)使用美国Waters公司的2414 型凝胶渗透色谱仪，流动相为四氢呋喃，流速1.0 mL/min，校准物质为单分散聚苯乙烯。

1.3.2 热性能分析：膜的热稳定性使用美国Universal 公司的2050 型热重分析仪(TGA) 测定，氮气保护下以20 ℃/min 的升温速率从室温加热到600 ℃；热转变使用美国TA 公司的2910 型差示扫描量热仪(DSC)，以液氮为冷却剂，以10 ℃/min 的升温速率从-40 ℃加热到180 ℃对材料的熔融行为进行测试。

1.3.3 结晶结构分析：通过德国布鲁克公司D8 AVANCE 型X 射线粉末衍射仪（XRD）表征材料的结晶性。将膜材料裁剪为1 cm×1 cm 正方形置于样品台，设定电压和电流分别为40 kV 和20 mA，以15(°)/min 的速度在2θ为5°～55°范围内进行扫描。

1.3.4 亲水性和溶胀率测试：材料表面的亲水性通过其表面与水形成的接触角进行测定，将膜材料裁剪为1 cm×1 cm 大小，使用芬兰KSV 公司的CAM200 型水接触角测试仪进行测试，每个样品测定3 次，取平均值。溶胀率采用平衡吸水率的方法测定，将完全干燥的膜材料（1 cm×1 cm，质量记为mo）浸入PBS 溶液中(pH=1.5，7.0，11.5)，每隔一段时间用滤纸擦除表面水渍后称量，直至质量不再增加，即达到平衡溶胀，质量记为mp，每个样品平行测量3 次。平衡吸水率（WU）通过式(1)计算:

1.3.5 力学性能测试：根据国际标准ISO 527-2-2012，将材料裁剪为标准哑铃状，在单柱拉力机(HY939C 型，恒宇)上进行拉伸测试，拉伸速率为50 mm/min。

1.3.6 体外模拟降解分析：通过质量损失法测定膜材料的水解降解性。将干燥的1cm×1 cm 大小的膜材料称量后记为m0，浸入模拟体液(SBF)，密封后置于(37±0.5)℃的生物培养箱中，每隔一段时间后将膜材料取出，干燥后称质量为mn(n=1,2,3,…)，直至膜材料完全破碎无法称量。每个样品平行3 次。通过式(2)计算降解失重率（W）

1.3.7 药物缓释分析：将4.0 g 膜材料和40 mg 头孢西酮溶于150 mL DMF 中,通过溶剂挥发法制备载药膜材料。取3 份一定质量的膜材料，分别浸入PBS溶液(pH=1.5，7.0，11.5) 中，密封置入(37±0.5)℃的生物培养箱中，每隔2 h 后取1 mL 的PBS 溶液，稀释至一定浓度后用紫外分光光度计测定204 nm 的吸光度，根据标准曲线计算药物释放量。头孢西酮在不同pH 值的PBS 溶液的标准曲线如下：

1.3.8 细胞毒性分析：以小鼠L929 成纤维细胞为实验细胞，通过MTT 法[16,17]测定膜浸出液的细胞毒性。先用乙醇清洗材料表面，紫外灭菌20 min 后用3 mL DMEM (添加10%牛胎血清)中提取浸出液，将浸出液按体积比1:1 稀释后取0.1 mL 加入培养板中，以5×104mL-1的密度接种L929 细胞。空白对照为新鲜培养液中的L929 细胞。将细胞在37 ℃，5%CO2条件下进行培养72 h，用0.5 mg/mL 噻唑蓝(MTT)测定细胞毒性。使用酶标仪测定570 nm 处的吸光度，与对照组参照，计算细胞存活率。

Fig.21H-NMR spectra for (a) MDI, (b) PyDH, (c) PECL and (d)PEEU-Py-1/8

2 结果与讨论

2.1 核磁共振分析

MDI，PyDH，PECL 和PEEU-Py-1/8 的1H-NMR 见Fig.2 (PEEU-Py-1/2～1/8 的谱图基本一样，这里以PEEU-Py-1/8 为 例)。 在PyDH 的1H-NMR 谱 图(Fig.2b)中，δ7.28～8.48，δ4.64～4.82，δ3.61 和δ2.53～3.36 分别为吡啶环、羟基、次甲基和亚甲基上的质子峰，并且没有出现烯键(δ6.75)和巯基(δ2.07)的质子峰，说明双键与巯基完全反应。在PECL 的1H-NMR谱图(Fig.2c)中，δ4.06，δ2.29 和δ3.64 处的峰可归于PCL 和PEG 链段中的亚甲基质子峰。根据峰面积之比，说明开环反应完全，不存在残留的单体ε-CL。而在PEEU-Py-1/8 的1H-NMR 谱图(Fig.2d)中，羟基峰消失，说明羟基与—NCO 完全反应，同时还保留了苯环、吡啶环和PECL 中亚甲基的质子峰。从以上分析可以确定PEEU-Py 的成功合成，其化学结构符合预期。

Fig. 3 IR spectra of (a) MDI, (b) PyDH, (c) PECL and (d) PEEUPy-1/8

2.2 红外光谱分析

Fig.3 为MDI，PyDH，PECL 和PEEU-Py-1/8 的IR谱图（PEEU-Py-1/2～1/8 的谱图基本一样，这里以PEEU-Py-1/8 为例）。在PyDH 的IR 谱图(Fig.3b)中，1618 cm-1和1422 cm-1处的吸收峰分别为吡啶环中的C=N 和C=C 的吸收峰，说明PyDH 含有吡啶环结构，同时没有出现S—H 的吸收峰，说明不存在未反应的 巯 基。在PECL 的IR 谱 图(Fig.3c)中，1092 cm-1，1723 cm-1和3510 cm-1处的吸收峰分别为醚键C—O—C、酯基中的C=O 和末端羟基的—OH 的吸收峰，不存在环酯基中的C=O 吸收峰(1760 cm-1)，说明ε-CL 发生了开环反应，产物中无单体残留。将PEEU-Py-1/8 (Fig.3d) 与MDI(Fig.3a) 的IR 谱 图 相比，—NCO 的吸收峰(2270 cm-1)完全消失，新生成了氨基甲酸酯的吸收峰(3325 cm-1和1732 cm-1)，同时还保留了PyDH 和PECL 各部分结构的吸收峰，进一步确定聚氨酯的合成。

2.3 热转变分析

PEEU-Py 膜的DSC 曲线及相应的特征值分别见Fig.4 和Tab.2。从曲线中可以发现，所有膜材料只出现1 个玻璃化转变温度(Tg)，说明软硬段的微相分离程度较低。这一方面是由于氨基甲酸酯中的—NH—与C=O 之间形成了分子间氢键，限制了分子链段的运动能力；另一方面，柔性的PEG 链段起到增塑的作用，降低了软硬段之间的极性差异。另外，还可以发现所有DSC 曲线存在1 个较宽的熔融吸热峰(Tm)，这表明PEEU-Py 具有一定的结晶性，但吸热峰的焓变较小，说明结晶性较低。从Tab.2 中可以发现，随着PyDH 含量的增加，PEEU-Py 的Tg从28.7 ℃逐 渐 增 加 至28.3 ℃、Tm从85 ℃增 加 至104 ℃，然而各吸热峰的焓变值（ΔHf）却从12.6 J/g降低至3.4 J/g。这归因于PyDH 中含有刚性的吡啶环结构，PyDH 含量增加，形成的氢键也越多，限制了链的运动，从而降低了材料的微相分离结构，导致低的结晶能力。

Fig.4 DSC curves of PEEU-Py films

2.4 结晶性分析

Fig.5 为PEEU-Py 膜材料的XRD 曲线。从图中可以发现，所有膜材料在2θ=21.5°均出现1 个宽而散的衍射峰，表现出典型的低结晶聚合物的特征。随着PyDH 含量的增加(PEEU-Py-1/2～1/8)，衍射峰的强度逐渐降低，应为硬段含量的增加导致了分子链之间的氢键增加，限制了分子链的有序排列。XRD 结果与DSC 曲线分析相一致。

Tab.2 Thermal transformation properties of PEEU-Py films

Fig.5 XRD patterns of PEEU-Py films

2.5 表面亲水性和溶胀率

通过测定膜表面水接触角来评价PEEU-Py 表面的亲水性，结果如Fig.6 所示。从图中可以看出，PEEU-Py 膜材料表面呈现一定的亲水性，但亲水性较低。随着PyDH 含量的增加(PEEU-Py-1/2～1/8)，水接触角从72.3°逐渐降低至57.8°, 膜表面亲水性逐渐增强。这是因为材料表面的亲水性与其表面的亲水组分相关，在PEEU-Py 中含有2 种亲水组分，分别是PEG 链段和吡啶基团。随着PyDH 的增加，PEG含量相对降低，但吡啶环的增幅要大于PEG 链段的降幅，同时，吡啶基团位于侧链，其N 原子更容易与水形成氢键，形成富集在材料表面的亲水层，所以整体表现为亲水性逐渐增强的趋势。

Fig. 6 Surface water contact angle of PEEU-Py films

材料溶胀性通过其平衡吸水率来测定，Fig.7 为PEEU-Py 膜材料在不同pH 值介质中(pH=1.5，pH=7.4和pH=11.5)的平衡吸水率。从图中可以发现，所有PEEU-Py 膜材料在3 种pH 环境下都表现出相似的溶胀行为, 其平衡吸水率为：酸性介质＞中性介质＞＞碱性介质。在pH=1.5 的介质中，膜的平衡吸水率分别为pH=7.0 和pH=11.5 的2 倍和8 倍以上。随着PyDH 质量分数从8.24% 增加到21.19%(Tab.1)，平衡吸水率在酸性介质中逐渐增大，而在中性介质基本不变，碱性介质中反而略微下降。这与吡啶基团的pKb=8.75 相一致，该溶胀行为表明PEEU-Py 膜随着外界酸碱条件的改变表现出优异的pH 敏感性。这是因为在酸性条件下，吡啶环上的N原子容易与H+质子化形成NH+，不仅亲水性更强，而且破坏了吡啶环与氨基甲酸酯基团之间的氢键，同时带电基团之间静电斥力也导致网络空间的增大，更易水分子进入材料内部；在碱性(或中性)条件下，吡啶环与氨基甲酸酯之间还可以形成额外的氢键，从而使网络结构更加致密可进一步阻碍水分子的进入，导致低的平衡吸水率。PEEU-Py 灵敏的pH 敏感性，还因为位于侧链的吡啶基团具有更高的自由度，更易与介质中的H+发生作用。总的来说，PEEU-Py 有优异的pH 响应性，有望用作智能控制药物释放载体的可逆开关。

Fig. 7 Equilibrium water absorption of PEEU-Py films

Fig. 8 Stress-strain curves of PEEU-Py films

2.6 力学性能

材料的力学性能与其组成及分子链排布密切相关，这对应用于医学领域的生物材料具有重要的意义。Fig.8 为PEEU-Py 膜在室温下的应力-应变曲线，从曲线中得到的特征值见Tab.3。所有PEEU-Py样品都呈现出一个平滑的屈服点，这表示材料从弹性到塑性的转变。随着PyDH 含量的增加(PEEUPy-1/2～-1/8)，断裂强度和弹性模量逐渐增加，分别从1.8 MPa 和0.9 MPa 增 加 至12.1 MPa 和9.6 MPa；断裂伸长率依次降低，从1667%降低至502%。这主要归因于硬段含量的增加，与文献报道的规律一致[18]。总体而言，PEEU-Py 膜具有优异的拉伸性能，可以满足其作为医疗卫生材料对力学性能的要求。

2.7 体外模拟降解

生物可降解是作为药物载体高分子材料的必要前提，通过检测材料在SBF 中的质量损失来研究PEEU-Py 的降解性，失重曲线如Fig.9 所示。可以看出，PEEU-Py-1/2 降解速率最快，在第9 周后已完全破碎无法称量，失重率达到50.4%。随着PyDH 含量的增加(PEEU-Py-1/2～1/8)，其降解失重率依次降低。PEEU-Py 的降解主要是酯键的水解降解，所以降解速率主要受酯键含量和与水接触程度的影响。随着PyDH 含量的增加，一方面材料中酯键的相对含量逐渐降低；另一方面，硬段含量的增加会使分子链间形成更多的氢键，从而导致更紧密的三维结构，抑制了水与酯键的接触，降解速率降低。

Fig. 9 Mass loss curves of PEEU-Py films against degradation time in PBS (pH=7.4)

2.8 药物缓释

Fig.10 和Fig.11 分别为PEEU-Py-1/8 膜材料的药物释放曲线(其他膜材料药物释放趋势与之相同)和不同PyDH 含量的PEEU-Py 膜在不同pH 值介质下的最大药物释放量。从Fig.10 可以发现，PEEU-Py-1/8 膜材料在不同pH 值的药物释放速率和药物释放量存在明显差异：在pH=1.5 环境下药物释放速率最快，在24 h 后药物释放量能够达到81.5%；在pH=11.5 环境下药物释放速率最慢，24 h 后的药物释放量不足15%。这说明以PEEU-Py-1/8 材料为载体的药物释放具有灵敏的pH 响应性，pH 值越低，药物释放量越高，药物释放速率越快。此外，在pH=1.5 和pH=7.0 环境下，最大药物释放量随着PyDH 含量的增加而增加(Fig.11)，而在pH=11.5 环境下恰恰相反。这一趋势与前面的溶胀率(或吸水率)结果相一致：高溶胀度形成的松散结构加速了药物的扩散。而碱性条件下最大药物释放量降低，还可归因于头孢唑酮与聚合物链段形成的氢键抑制了药物的扩散。以上结果表明，PEEU-Py 材料在作为由体内pH值触发开关的药物缓释载体方面有较高的潜在应用前景。

Fig. 10 Drug release curves from the PEEU-Py-1/8 film under different pH conditions

2.9 细胞毒性

细胞毒性测试是评价材料生物相容性的重要指标之一，通过MTT 法检测PEEU-Py 材料提取物对L929 细胞的细胞毒性，结果如Fig.12 所示。可以发现，随着时间的延长，细胞存活率稍稍微降低，但培养72 h 后，所有样品的细胞存活率仍然在75%以上。按照GB/T 16886.20-2015 标准，为Ⅰ类细胞毒性，说明该材料具有对良好的细胞相容性，满足体内材料的要求。另外，所有的膜材料提取物相同培育时间下细胞活性无明显差异，说明PyDH 含量对细胞毒性的影响较小。细胞毒性结果表明该材料无明显细胞毒性，可以满足其作为生物医疗材料对细胞毒性的要求。

Fig.12 Cell viability in the PEEU-Py films extracts by MTT

3 结论

本文设计和制备了一种pH 响应型可降解聚氨酯(PEEU-Py)材料，并对其化学结构和理化性能进行了表征和研究。结果表明该材料不仅具有水解降解性，并且具有优异的pH 响应性，在pH=1.5 的条件下，膜材料的平衡溶胀率分别是pH=7.0 和pH=12.0条件下的2 倍和8 倍以上；药物缓释效率主要受溶胀性能的影响，随着介质pH 值的降低，药物释放效率提高。此外，通过对膜材料提取物的细胞毒性测验，细胞存活率超过75%，表明该材料具有良好的细胞相容性，可作为体内材料使用。总之，高pH 响应型的可降解PEEU-Py 材料具有作为生物开关的应用潜力，可以通过外部pH 环境变化进行药物的靶向释放，在智能药物输送装置方面有较高的应用前景。