丝氨酸/丝氨酸激酶信号通路与脑出血关系的研究进展

张 策，邹 伟

脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)指非外伤性的脑实质内出血，发病后多遗留严重的神经功能损伤[1]。神经元死亡是其中重要的病理因素。丝氨酸(Rho)/Rho激酶信号通路是可调节细胞骨架关键蛋白-肌动蛋白聚合解聚状态的重要信号通路，参与一系列的细胞生理过程且与多种脑血管疾病的发病过程密切相关。现对Rho/Rho激酶信号通路的基本生物学特征、生理学作用及其与脑出血的关系进行综述。

1 Rho/Rho激酶信号通路基本生物学特征

1.1 Rho A Rho蛋白-Ras相关单体鸟嘌呤-5′-三磷酸(GTP)酶可被多个上游分子所活化，调节细胞外刺激介导信号传导系统，参与肌动蛋白的组织和周期的调节。Rho A是Rho家族(Rho A、Rho B、Rho C等)中最重要、最直接的一个Rho激酶，上游刺激信号调控如神经突、轴突生长、树突形成、神经元迁移等，还影响着细胞分化、黏附、迁移、增殖、凋亡等细胞功能[2]。在中枢神经系统中肌动蛋白的聚合重组作用是神经元轴突的延伸推动细胞膜向前移动的必要条件[3]，减少Rho A的表达可以降低其对神经受损后重塑的抑制作用。在轴突和突触重塑的过程中Rho A能够激活下游Rho相关激酶的信号传导活化后的Rho A，可以与其下游信号通路上的10多种蛋白结合而产生不同的生物效应。

1.2 Rho相关激酶(Rho-associated kinase，ROCK)Ⅱ Rho下游通路上的信号分子ROCK，是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员，是细胞再生、增殖、凋亡、转录和分化的关键分子[4]。ROCK主要有两个亚型，分别是ROCK Ⅰ或称ROK β、ROCK-1、P160-ROCK，主要分布在心脏、血管和骨骼肌等[5]；另一个是ROCK Ⅱ或称ROK α、ROCK-2[6]；主要在中枢神经系统的皮质、海马中表达[7]。ROCK Ⅰ蛋白和ROCK Ⅱ蛋白的氨基酸同源率高达65%，与Rho蛋白结合域(Rho-binding domain，RBD)的同源率高达58%[8]。ROCK的激酶活性在静息状态下具有一定的自我抑制，其羧基端主要起抑制作用；其活性端主要位于氨基酸，活性端与Rho A结合后，空间结构暴露活性中心，从而表现出催化活性作用[9]。

1.3 Rho-kinase效应分子 Rho激酶的下游靶分子包括肌球蛋白轻链(myosin light chain，MLC)、肌球蛋白轻链磷酸酶(myosin light chain phosphatase，MLCP)等[10]。其中MLC是ROCK的作用点位之一，可直接作用于Rho激酶。一方面，MLCP在肌球蛋白结合亚基(myosin-binding subunit，MBS)参与的条件下，与磷酸化肌球蛋白轻链(phospho-myosin light chain，p-MLC)联结[11]，或直接磷酸化MLC[12]，使其脱磷酸；另一方面，Rho激酶激活后磷酸化肌球蛋白结合亚基，使MLCP失活[13]，MLC磷酸化水平升高，血管痉挛[14]，但可被Rho激酶抑制剂所翻转[15]。

1.4 Rho/Rho激酶信号通路的生物学作用 Rho/Rho激酶信号通路中的主要信号分子为Rho GTP酶、ROCK和MLCP。Rho激酶激活途径主要有两种：一是通过异源三聚体G蛋白偶联受体(G protein coupled prot，GPCR)、受体酪氨酸激酶(receptor protein tyrosine kinase，RPTKs)及细胞因子受体(cytokine receptor)的活化[16]；二是通过细胞黏附(cell adhesion)及整合素/整联蛋白(integrin)的激活及鸟苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factors，GEFs)、GTP 酶激活蛋白(GTPase activating proteins，GAP)和GDP解离抑制蛋白(GDP dissociation inhibitor，GDI)的共同调节作用完成[17]。三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)作用于Rho激酶后，使其磷酸化，促使Rho释放二磷酸鸟苷(guanosine diphosphate，GDP)，活化成Rho GTP酶后与ROCK的Rho蛋白结合，改变了Rho激酶的空间构型，暴露活性点位，激活Rho激酶[18]，从而导致血管收缩，引发相关脑血管疾病。Rho/Rho激酶信号通路通过Rho与GTP酶结合激活下游ROCK，并进一步磷酸化ROCK下游底物，重塑细胞骨架、诱导肌动蛋白丝(actin filament)稳定和肌动蛋白-肌球蛋白收缩组合肌动蛋白网和肌球蛋白纤维调节微管动力[19]。

2 Rho/Rho激酶信号通路的生理学作用

2.1 Rho/Rho激酶信号通路对炎性因子的影响 分子免疫学和分子生物学研究认为，脑水肿的形成可在颅脑损伤后急性期/神经源性炎症反应下持续加重[20]。中枢神经系统(CNS)的细胞释放或聚集具有神经毒性的内源性炎性因子[如白细胞介素-1β(1L-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等][21]，引起血-脑屏障破坏，加重脑水肿和神经元凋亡[22-24]。Li等[25]发现神经系统炎症反应、细胞死亡和脑水肿可由1L-1β、TNF-α引起。龚浩等[26]的研究发现，血清TNF-α水平能辅助判断急性脑出血病人近期预后情况，且与其神经功能损伤密切相关。

Rho/Rho激酶信号通路激活后，通过与炎症反应的相互作用使血管内皮通透性增高，单核巨噬细胞和炎性因子穿过脑血管[27]，加重炎症反应及脑水肿程度。TNF-α可直接破坏细胞间紧密连接，增加血-脑屏障通透性，也可通过其受体激活Rho GTP酶，促进MLC磷酸化，提高平滑肌对Ca2+的敏感性，血管平滑肌收缩，加重脑水肿细胞毒性。Chen 等[28]研究发现，Rho GTP激酶抑制剂可转录白细胞介素-6(IL-6)mRNA，减少1L-1β、TNF-α、IL-6等炎性因子的产生。Rho激酶还参与白细胞与内皮细胞间“对接”结构的形成等炎症反应过程[29-30]。Rho激酶通过调节炎症反应参与了血脑屏障的破坏和颅脑损伤后脑水肿。

2.2 Rho/Rho激酶信号通路对血管和组织内皮通透性的影响 ROCK介导的细胞骨架收缩性可调控紧密连接蛋白claudin-5的连接点位和连接稳定性，由此保护淋巴内皮屏障的完整性[31]。磷酸化MLC(p-MLC)水平升高及去磷酸化均可导致血管屏障的破坏，p-MLC受细胞内Ca2+浓度影响，通过内源性(如组胺、凝血酶、血管内皮生长因子及脂多糖)和外源性(如机械作用)刺激而被激活后的RhoA与ROCK结合促进钙调蛋白(calmodulin，CaM)形成[32]，从而增加细胞内Ca2+浓度，活化肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase，MLCK)，由此升高了p-MLC水平[33]；磷酸化的MLCP抑制p-MLC去磷酸化，增加血管内皮通透性，破坏血管屏障[34-35]。此外，Rho/Rho激酶信号通路激活后可以破坏紧密连接，表现在血管时可有血管屏障受损，表现在肠内皮细胞时可有肠壁通透性增加、屏障受损[36]。

2.3 Rho/Rho激酶信号通路对组织收缩及生长的影响 Rho/Rho激酶信号通路可以诱导组织对Ca2+敏感性增加，增强平滑肌细胞收缩[37]并诱导MLCP和MLC磷酸化，ROCK Ⅱ是该过程中起主导作用的亚型[38]。在病理情况下这种多重效应可能导致血管痉挛，诱发脑出血。ROCK Ⅱ通过黏着斑(focaladhesion)的形成和成熟调节成肌细胞的定向移动，促使骨骼肌的生长和再生[39]。Rho/Rho激酶信号通路还可调控神经细胞生长锥和轴突再生和突触的数目结构[40]。因此，Rho/Rho激酶信号通路的失活，神经生长抑制因子释放减少，中枢神经损伤后突触再生，减轻轴突损伤，神经细胞轴突生长锥(growth cone)的体积增加、运动性提高、轴突延伸过程启动，对治疗脑出血中神经损伤有重要意义。

3 Rho/Rho激酶信号通路对血-脑屏障的破坏

血-脑屏障能控制脑内物质交换，维持脑内稳态，保证中枢神经系统功能的正常发挥，而内皮细胞间的紧密连接(tight junctions，TJs)对于微环境的改变更加敏感，是血-脑屏障功能变化的基础，使脑微血管内皮细胞(brain microvessel endothelia cells，BMECs)紧密相连发挥血-脑屏障的屏障作用。Rho/Rho激酶信号通路的激活，与血-脑屏障内皮功能损伤有重要联系，对紧密连接和内皮细胞屏障有反向调节作用[41]。参与构成血-脑屏障紧密连接成分的闭合蛋白-5(claudins-5)，在脑血管内皮细胞中高度表达，对调节血-脑屏障通透性起关键作用。研究表明，ROCK活化后，使p-MLC水平上调，紧密连接屏障功能降低，claudin-5蛋白表达减少，或上调基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)的表达，降低基底膜导致的血-脑屏障通透性增加，扩大脑水肿，促进炎性细胞浸润及不断进展[33，42]。在脑微血管内皮细胞中抑制该通路能诱导咬合蛋白(occludins)和claudin-5的磷酸化[43]。因此，Rho/Rho激酶信号通路对维持血-脑屏障结构完整性具有重要作用[44]。

4 Rho/Rho激酶信号通路与脑出血

血-脑屏障被破坏是脑出血所致脑损伤的重要标志[45]。脑出血后血脑屏障被破坏，白细胞的流入以及潜在的神经活性物质进入大脑组织可导致脑损伤[46]。炎症介质反应(如炎性细胞和趋化因子)、凝血酶的释放、血红蛋白降解产物、氧自由基的活性、补体系统的平衡以及基质金属蛋白酶的水平升高，并在数小时内在血肿周围引起水肿[47]。此外，脑出血后Rho/Rho激酶信号通路被激活，Rho A与ROCK Ⅱ结合，使p-MLC水平升高，血-脑屏障功能减弱，紧密连接蛋白发生解体，脑微血管内皮细胞通透性增加进而形成脑水肿[48-49]。在中枢神经系统中[50]，Rho/Rho激酶信号通路还可介导氧化应激，使氧自由基的生成增多、抑制神经细胞再生。脑出血后，Rho/Rho激酶信号通路对内皮细胞黏附分子的表达，血管平滑肌的收缩与舒张以及相关细胞迁移等作用动态和持续，促进脑血管重构[51-52]。因此，Rho/Rho激酶信号通路在血-脑屏障被破坏的病理过程中扮演了重要角色。

5 Rho/Rho激酶信号通路抑制剂与脑出血

5.1 Rho/Rho激酶信号通路抑制剂的作用机制 Rho/Rho激酶参与脑出血病理机制的发生发展过程，血钙离子浓度异常能够激活细胞表面受体，使Rho蛋白从胞浆转位至细胞膜并与三磷酸鸟苷结合后活化，损伤神经与内皮细胞。Rho/Rho激酶信号通路抑制剂可作用于多个靶点，通过降低炎症反应、氧自由基产生提升Ca2+浓度拮抗凝血等作用，实现逆转神经元损害，改善轻度认知功能障碍；通过调节血管内皮细胞氧化应激和紧密连接，保护血管内皮细胞的通透性，修复血-脑屏障功能等[53-54]。法舒地尔是异喹磺酰胺类药物，是目前唯一应用于临床的新型Rho激酶抑制剂，其他类抑制剂仅限于实验研究。

法舒地尔作为Rho/Rho激酶信号通路抑制剂，是治疗脑血管痉挛的一种强效血管扩张剂，能双重抑制磷酸化，包括Rho激酶系统、MLCP等，进而抑制炎症反应、自由基形成，促进神经损伤后修复。法舒地尔易与Rho激酶催化结构中的ATP结合位点相结合，因此，对Rho的选择抑制性较强并且能在无Ca2+的情况下，抑制肾上腺素受体(adrenergic receptors，ARs)活化引起的血管痉挛[55]。

5.2 Rho/Rho激酶信号通路抑制剂在脑出血中的作用 目前，脑出血内科治疗措施主要包括安静卧床，避免情绪波动；以脱水、降颅压为治疗基础，亚低温治疗为辅；保持呼吸道通畅、调整血压与血糖、止血等。但临床疗效不佳，总体预后差。多项关于脑出血临床疗效及动物实验研究证明，法舒地尔一方面能有效缩小脑水肿体积，维护血-脑屏障[56]；另一方面改善脑出血后遗症期脑内物质能量代谢，减少有害代谢产物堆积[57]。

2011年，宋明浩等[58]对78例脑出血病人的研究发现，法舒地尔组病人格拉斯哥昏迷量表评分、格拉斯哥预后量表评分、脑水肿体积明显优于常规治疗组。2015年，Lee等[59]建立脑出血大鼠模型，采用Wharton氏胶质源性骨髓间充质干细胞，证明法舒地尔可促进脑出血后神经功能的恢复。该过程可能是通过促进胶质源性神经营养因子的表达从而使其向类神经元细胞分化。2017年，Dang等[60]研究发现，法舒地尔能保持脑出血大鼠模型血脑屏障的完整性，以及MMP-9引起血管基质降解。2018年，Akhter等[5]的实验研究表明，法舒地尔对Rho激酶参与脑出血病理过程存在一定的保护作用。Zhou等[61]的实验研究证实法舒地尔通过抑制Rho/Rho激酶信号通路，使内皮细胞稳定，减少出血发生和缩小出血面积，从而改善脑出血病人预后。2019年，游海锋[62]对74例高血压脑出血术后病人采用醒脑静联合盐酸法舒地尔治疗，结果显示，可改善神经功能和认知功能，促进意识恢复。2019年日本卒中中心的一份关于质量指标及其测量的可行性一文中指出，法舒地尔可减轻脑血管痉挛[63]。

6 小 结

脑出血发病机制复杂[47]。在其病理变化过程中，脑水肿是否发生及其发生程度极大地影响了病情发展及转归。脑出血发生后，通过降低Rho/Rho激酶信号通路的活性，可改善血流状态，抑制炎症介质的释放，改善神经细胞功能，调节认知障碍。以Rho/Rho激酶信号通路作为脑出血后神经元损伤的干预靶点，分析Rho/Rho激酶信号通路抑制剂(法舒地尔)的作用机制，对脑出血的治疗具有重要的临床意义。