内质网应激介导的细胞凋亡在糖尿病周围神经病变中的机制研究进展

徐利娟，马丽

(新疆医科大学附属中医医院内分泌科，乌鲁木齐 830000)

随着现代经济的发展和人们物质消费观念的变化，糖尿病的患病率不断升高，患病群体逐渐低龄化。目前我国2型糖尿病患病率较高，糖尿病患者约1.5亿，18岁以上人群糖尿病患病率为11.2%[1-2]，糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病最常见的并发症，约50%的糖尿病患者并发DPN[3]，主要是感觉神经病变，伴自主神经病变，随着疾病的进展，常有运动神经病变的特征[4]，表现为痛觉过敏、感觉异常等[5]。DPN的发病机制复杂，目前确切的发病机制尚不完全清楚，相关研究主要集中在醛糖还原酶活性增加、晚期糖基化/糖氧化、氧化硝化应激、蛋白激酶C、12/15脂氧合酶和受损的神经营养支持等方面[6]。

DPN机制复杂，目前尚无有效的DPN治疗方法。内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)作为细胞蛋白质的质量控制系统，参与蛋白质的合成、折叠和运输，并且作为细胞内钙储存和细胞应激的传感器，在慢性炎症、应激、高糖等状态下，ERS反应和未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)激活，通过降低细胞内分泌蛋白的负荷增强蛋白质折叠能力或启动不能恢复的细胞凋亡，以维持细胞内的蛋白质稳定，目前认为ERS是诱导细胞发生凋亡的关键。DPN的发病机制众多，其中高血糖是DPN发生发展的主要原因[7]。近年发现，ERS在DPN发病过程中起重要作用[6]。现对ERS介导的细胞凋亡在DPN发病机制中的研究进展予以综述。

1 ERS介导的细胞凋亡

DPN的发生发展与ERS诱导的细胞凋亡密切相关[8]。细胞内1/3的蛋白质合成、折叠和结构成熟均发生在内质网，几乎所有内质网、高尔基体和溶酶体中的蛋白质都在内质网膜结合的核糖体上翻译并注入内质网腔。内质网是由一层单位膜形成的囊状、泡状和管状结构，分布在细胞质内侧，不仅能保证细胞内钙和脂质的稳态，还具有胞内物质转运功能，其中包括分泌蛋白的折叠。靶向内质网的蛋白质有一个N端信号序列，该蛋白质首先在核糖体上合成，进而N端信号序列将其导向内质网膜。这些蛋白质通过转座子复合体进行共翻译，当翻译完成时，蛋白质上的信号序列被蛋白酶去除进入内质网腔，并且折叠成独特的三维形状，并经历各种翻译后修饰，包括糖基化和二硫键的形成[9]，上述过程都需要不同酶的催化，同时内质网的稳态也有赖于其内部富含的多种酶，包括伴侣酶、糖基化酶等。正确折叠的蛋白质通过分泌途径输出，而不正确折叠的蛋白质在内质网相关降解过程中被特定的蛋白酶体降解。影响内质网稳态的生理、化学和病理因素均可导致其正常稳态被打破，引发ERS，为了应对这种情况，细胞激活适应性信号通路——UPR通过翻译后、翻译、转录后和转录机制进行转导[10]，并通过促进蛋白质折叠、减少蛋白质翻译和促进蛋白质降解恢复内质网稳态，这是细胞在压力条件下所产生的自我保护与生存的功能，在轻度ERS下，蛋白质折叠能力和细胞存活恢复，但持续的不可溶解的UPR激活可通过触发凋亡程序消除应激细胞[11]。

每个胰岛β细胞每分钟能合成和分泌100万个胰岛素分子，在胰岛素抵抗状态下，这种蛋白质合成负荷更大。发生糖尿病时，机体细胞处于高糖状态，这种高糖状态将会对细胞的代谢途径产生影响，出于自我保护机制，细胞会自行启动UPR，然而持续的高糖状态可导致UPR触发细胞凋亡。文献指出，在机体自身生理条件下，葡萄糖调节蛋白(glucose-regulated protein，GRP)78与蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)、激活转录因子(activating transcription factor，ATF)6以及肌醇需求酶1(inositol requiring enzyme 1，IRE1)[12]的调节管腔结构域结合，使其处于非活性状态。发生UPR时，未折叠或错误折叠的蛋白质竞争与GRP78结合，导致GRP78分别与PERK、ATF6、IRE1分离，其下游通路分别被激活[13]。通过PERK-真核起始因子(eukaryotic initiation factor，eIF)2α-ATF4、IRE1-c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)/胱天蛋白酶(caspase)12 和ATF6信号途径的激活导致C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)增多，使促凋亡和抗凋亡蛋白的表达分别形成正负调节趋势，caspase家族蛋白表达增多，促使细胞发生凋亡。研究表明，注射ERS诱导剂衣霉素健康大鼠后肢出现明显疼痛、持续热反应丧失，且触觉刺激异常敏感，类似于啮齿动物DPN的行为特征；进一步实验发现，服用ERS抑制剂4-苯基丁酸数分钟内糖尿病大鼠的缩足时间即改善，抗伤害作用呈剂量和时间依赖性，与局部给药相比，全身给药的效果改善更确切，表明高血糖介导的ERS发生在外周神经中，对DPN的发生起促进作用[14]。在高血糖状态下，抑制ERS能够明显改善运动神经及感觉神经传导速度，减轻小的感觉神经纤维功能障碍和变性。口服链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型的坐骨神经中GRP78表达降低，神经传导速度及其对机械和热刺激的行为反应改善，与野生型小鼠相比，注射链脲佐菌素C57B6 CHOP-/-小鼠的神经功能改善更明显，GRP78表达增加，进一步说明ERS在DPN发生、发展中具有不可忽视的作用[15]。

2 ERS信号通路在DPN中介导的细胞凋亡

2.1PERK-eIF2α-ATF4信号通路 PERK是一种Ⅰ型跨膜蛋白，当细胞处于应激状态，PERK与GRP78解离后形成二聚体并发生自身磷酸化，自身磷酸化的PERK可使eIF2α发生磷酸化，进而阻断eIF2α循环，同时抑制蛋白质合成所需的eIF2β鸟嘌呤核苷酸的交换活性，磷酸化的eIF2α可选择性地诱导ATF4信使PNA(messenger RNA，mRNA)转录，转运到细胞核上的ATF4可减弱整体翻译并减少内质网腔蛋白负荷，恢复内质网稳态所需的蛋白质和伴侣的表达[16]，当细胞持续处于高糖状态时，其ERS持续被激活，ATF4持续过表达则会激活CHOP等基因的表达，CHOP是ERS诱导细胞凋亡最重要的标志蛋白，在正常细胞稳态过程中普遍低表达，而持续的ERS导致CHOP高表达。PERK-eIF2α-ATF4信号通路是CHOP蛋白表达所必需的信号通路[17]；长期应激使细胞核内CHOP过量表达聚集，不仅能降低抗凋亡基因B细胞淋巴瘤/白血病-2的表达，加速细胞凋亡的发生[18-19]，而且能增加凋亡基因B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白从胞质转运至线粒体，从而激活caspase-3，导致细胞凋亡[20]。

PERK在糖代谢中有重要作用，研究表明，携带肝细胞特异性PERK缺失基因小鼠在其他代谢异常中表现出糖异生缺陷[21]。此外，Wolcott-Rallison综合征是一种罕见的常染色体隐性疾病，被称为人类糖尿病综合征，以PERK基因编码突变为特征，临床表现为2型糖尿病、骨质疏松症等，患者可出现多发性骨骺发育不良、生长迟缓等症状[22]。高糖状态下，高脂饮食联合链脲佐菌素诱导的2型糖尿病小鼠模型的PERK磷酸化水平显著升高，葡萄糖刺激的胰岛素分泌以及细胞内Ca2+转运均受到抑制，给予PERK抑制剂后，PERK磷酸化水平降低40%，葡萄糖刺激的胰岛素分泌和胞质钙水平明显恢复，血糖降低，其血糖降低程度与每日服用10 mg格列美脲的效果相似，说明PERK通路对2型糖尿病所致高血糖有一定作用[23]。

蛋白质二硫化物异构酶A6与PERK相互作用可抑制其蛋白反应，而在正常或高糖刺激下，沉默蛋白质二硫化物异构酶A6表达小鼠的胰岛素表达降低，表明PERK通路对糖尿病及DPN进程均有影响[24]。早期的报道表明，PERK抑制剂可防止神经退行性变，与正常大鼠相比，DPN大鼠模型坐骨神经及脊髓中的PERK水平分别增加32%和37%，磷酸化的eIF2α增加27%，CHOP水平增加18%，同时DPN大鼠出现一系列周围神经系统症状与体征[15]。研究表明，在DPN大鼠鞘内注射CHOP干扰小RNA后，DPN大鼠L4～5腰椎脊髓中PERK-ATF4-CHOP通路相关促细胞凋亡因子mRNA水平较前显著降低，大鼠周围神经脱髓鞘现象相应改善[25]。在高糖暴露下，DPN大鼠坐骨神经和施万细胞中CHOP、caspase-3和B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白/B细胞淋巴瘤/白血病-2水平均显著升高，表明ERS参与高糖状态下DPN的发生发展[26]。

2.2IRE1信号通路 IRE1是一种Ⅰ型跨膜蛋白，由一个N端管腔感受器结构域、一个跨膜结构域和一个C端胞质效应区组成[27]，其管腔结构域可感知错误折叠的蛋白质，ERS持续的时间与程度决定细胞是否发生凋亡。在持续的ERS作用下，游离IRE1α通过寡聚和反式磷酸化的方式被激活，进而激活X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1，XBP1)mRNA，并通过转录因子XBP1 mRNA的切割诱导XBP1的下游表达，最终激活下游凋亡蛋白CHOP[28]；除剪接XBP1 mRNA外，IRE1α活化后关联肿瘤坏死因子受体相关因子2和凋亡信号调节激酶1触发细胞死亡。IRE1α寡聚化能诱导许多促炎和促死亡蛋白的激活或上调，在ERS过程中，肿瘤坏死因子受体相关因子2、caspase-12和凋亡信号调节激酶1被招募到IRE1α的激酶结构域，JNK表达增加进而激活caspase-3表达，同时IRE1α与多种促凋亡蛋白形成大分子信号复合物[29]，促进促凋亡环境的建立，从而诱导细胞凋亡的发生。在持续高糖作用下，IRE1α通路的作用甚至强于PERK信号通路，IRE1被持续高血糖或化学ERS源(如三酰甘油)激活，通过调节IRE1依赖性衰减活性降解胰岛素mRNA，从而导致胰岛素原减少，缺乏IRE1α-XBP1小鼠表现出多种代谢异常，代谢异常的类型取决于所涉及的细胞类型。肝细胞特异性缺失XBP1小鼠出现胰岛素抵抗，胰岛β细胞IRE1α-XBP1途径的缺失导致严重的细胞功能障碍，包括胰岛素分泌减少，导致细胞胰岛素及胰岛素原水平降低，胰岛素原的氧化折叠减少[30]。IRE1α对高血糖的高敏感性提示其在DPN诱导的细胞凋亡中起重要作用[31]。研究表明，链脲佐菌素诱导的1型糖尿病大鼠后爪及坐骨神经中IRE1α的磷酸化水平升高，导致XBP1的总蛋白和mRNA水平以及GRP78水平显著升高。同样，p38促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和JNK1/2的磷酸化水平显著增加[14]。而敲除IRE1α基因或其抑制剂已用于干预糖尿病及其他代谢紊乱。实验研究表明，鞘内注射IRE1α干扰小RNA可使DPN大鼠和离体施万细胞的凋亡分别减少77%和65%，在体实验表明，抑制IRE1α可有效改善坐骨神经脱髓鞘病变，增加表皮神经纤维密度，提高运动、感觉神经传导速度。体外实验表明，转染IRE1α干扰小RNA可抑制施万细胞凋亡，这可能与DPN过程中IRE1通路中的相关凋亡蛋白CHOP和磷酸化JNK的下调有关[18]。用于治疗DPN的中药复方制剂糖络宁的含药血清已被证实可降低磷酸化的IRE1α/IRE1α和XBP1的表达，体外实验证实，高糖环境下，糖络宁干预的细胞内质网完整性较好，细胞凋亡数量减少[11]。

2.3ATF6信号通路 在ERS状态下，GRP78的解离导致PERK和IRE1发生寡聚和自磷酸化，而ATF6的激活则与其不同，当ATF6与GRP78分离后，ATF6从内质网转运到高尔基体，进而被两种丝氨酸蛋白酶(S1P和S2P)切割，切割后的片段转运入胞核，诱导GRP78、GRP94和内质网蛋白57等伴侣蛋白的转录[32]，增强内质网的蛋白折叠能力；此外，ATF6还可促进内质网相关蛋白的降解[33]。ATF6 信号通路对预防糖尿病小鼠胰岛β细胞的丢失至关重要，同时对维持DPN神经细胞的稳态发挥重要作用。高脂饮食以及过度或不足的运动可以激活骨骼肌中的ERS，而反复适度的耐力运动可减弱与内质网相关的各种伴侣分子激活，从而保护骨骼肌细胞。研究表明，糖尿病小鼠骨骼肌中ATF6的表达显著增加，游泳可以减少ATF6的表达，表明糖尿病激活了ERS，而游泳通过减少骨骼肌中ATF6的表达减弱ERS[34]。实验研究表明，在胰岛素抵抗以及糖尿病发生发展过程，ERS也作为主要机制参与其中，在慢性高血糖状态下，ERS是导致胰岛β细胞发生细胞凋亡的主要因素，进而降低胰岛素摄糖及耗糖能力。二甲双胍是经典的降糖药物，可提高糖尿病大鼠的胰岛素摄糖及耗糖能力，其作用机制为下调ATF6，改善大鼠ERS[35]，说明ATF6信号通路在糖尿病进展过程中起重要作用。在小鼠DPN模型中，XBP1的核易位受损可加重DPN，并与转录因子ATF6和CHOP水平增加有关[36]。

3 小 结

内质网与细胞的所有关键部分均存在密切的物理和功能联系，因此内质网是协调体内代谢平衡和内外应激反应的中心平台，慢性ERS引起的细胞损伤正成为糖尿病、神经退行性变、卒中和癌症等广泛流行的人类疾病的病理生理学核心。鉴于全球超重和肥胖的流行，了解内质网代谢适应的基础生物学可能为代谢紊乱提供新的治疗方法。ERS及其直接参与的细胞凋亡过程均为DPN患者以及动物模型DPN演变进程的重要环节，基于机制的治疗方法可以预防这种损伤级联并有效改善DPN的症状和体征，研发能够调节ERS相关分子的药物，可能为DPN的治疗提供新思路。一些天然化合物有助于内质网受体功能机制的研究，但药理学上，上述物质在人类疾病治疗中的应用仍面临较大挑战，包括ERS操作的多效性、化合物药理学靶向可能导致的非靶向不良反应等，但结合目前相关的科研学术成果推测，针对ERS途径的干预措施以及增强内质网功能是未来探索DPN治疗方法的新方向。