多发性骨髓瘤的CAR-T治疗研究进展

贾庆华，马俊，张富婷，牛廷献

(联勤保障部队第九四〇医院 a.检验科，b.基础医学实验室 甘肃省干细胞与基因药物重点实验室，兰州 730050)

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是骨髓中的一种克隆性浆细胞疾病，其特征是骨髓中的克隆性浆细胞不受控制地增殖且凋亡受阻，产生异常数量的单克隆免疫球蛋白并导致末端器官损伤[1]。MM是第二大常见的血液恶性肿瘤，约占所有癌症类型的1%，血液肿瘤的13%[2]。MM的发病机制与机体遗传学异常导致的基因突变、甲基化改变、基因和信使RNA失调以及造血微环境改变有关[3-4]。

随着蛋白体抑制剂、免疫调节药物以及单抗隆抗体等新药物的引入，MM的治疗方法显著增多。虽然MM治疗取得一定的进展，但是耐药性的产生和反复发病导致MM依然无法治愈。嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)治疗被认为是近年来最具前景的肿瘤新型疗法之一，已成功治疗了急性淋巴母细胞白血病和弥漫大B细胞淋巴瘤，CAR-T延长了患者的生存期和缓解期，对部分标准治疗失败的患者也有效[5]。现阶段研究的主要方向是提高CAR-T的功效和体内持久性，目前第1代嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)已经被更强大的第2代和第3代CAR所取代。为避免健康组织遭受CAR-T攻击，CAR-T目标抗原的选择对于CAR-T的疗效非常关键。在MM中，CAR-T治疗仍处于起步阶段。现就MM中CAR-T疗法相关抗原的研究进展及现阶段所面临的问题进行综述，为CAR-T治疗MM的基础研究和临床应用提供借鉴。

1 CAR-T的结构和作用机制

CAR-T治疗又称细胞免疫治疗或细胞过继免疫治疗，是将患者免疫细胞经体外处理，加入特异性抗原并用细胞因子刺激，从而筛选并大量扩增具有高度特异性的免疫效应细胞，然后回输到患者体内杀灭肿瘤细胞或病毒，临床应用多以自体免疫细胞为主。为了发挥特异和有效的抗肿瘤效应，T细胞被转导到一个由4个主要元素组成的结构，分别是单链可变片段(single-chain variable fragment，ScFv)、跨膜结构域、共刺激分子和刺激分子[6]。ScFv用于引导T细胞向肿瘤细胞转移，通常来源于针对肿瘤表面抗原的抗体可变区，其是免疫球蛋白重链和轻链可变区与短链连接的融合蛋白，在CAR-T治疗中起着至关重要的作用，决定了CAR-T治疗的特异性和有效性[7]。跨膜结构域由CD8、CD28或免疫球蛋白的疏水α-螺旋结构组成，这些疏水α-螺旋结构插入横跨细胞膜的膜脂双层中[8]。虽然跨膜结构域的主要功能是将CAR锚定在T细胞膜上，从而增加CAR-T与靶向肿瘤细胞的结合强度，但有证据表明其对T细胞的激活也有作用[8]。刺激和共刺激分子是T细胞完全激活所必需的，这是由经典的双信号假设定义的，其中信号1是由T细胞受体与抗原呈递细胞上的肽-主要组织相容性复合物之间的相互作用提供；信号2是T细胞上的共刺激分子CD28和抗原呈递细胞上的CD80(B7.1)或CD86(B7.2)相互作用介导的共刺激信号[9]。因此，目前CAR-T构建的版本既编码共刺激分子，也编码刺激分子。共刺激分子包括一个或多个：CD27、CD28、诱导性协同刺激分子、4-1BB、OX40[10]。目前尚不清楚这些分子的共刺激水平是否不同。目前最常用的刺激分子来自CD3ζ链。

2 CAR-T靶向MM抗原目标

识别合适的肿瘤相关靶抗原是CAR-T治疗成功的关键。一般来说，靶抗原必须同时具备有效性和安全性。首先，抗原必须在肿瘤细胞表面表达。事实上，CAR结合是以一种主要组织相容性复合物独立的方式发生，降低了人白细胞抗原下调导致的免疫逃逸风险[11]。扩大靶向抗原可以治疗更大范围的肿瘤，因此T细胞受体模拟CAR识别肿瘤抗原/人白细胞抗原复合物逐渐发展起来。其次，抗原在恶性细胞上均匀表达是肿瘤存活的理想条件。最后，靶点几乎不存在于相关的健康组织中，以最大限度地减少对非肿瘤组织的影响。由于MM细胞遗传和表型的异质性，同一MM患者细胞表面抗原的表达可能存在变化。靶向抗原应在MM细胞上特异性表达，以避免靶向肿瘤外毒性。但MM特异性抗原尚未被鉴定出来。几种抗原包括B细胞成熟抗原CD19、CD38、CD138、信号淋巴细胞激活分子家族成员F7 (signal lymphocyte activating molecule family member F7，SLAMF7)、κ轻链和B细胞成熟抗原(B-cell maturation antigen，BCMA)已被用作CAR-T治疗MM的靶点。目前CAR-T疗法尚未被批准用于MM的治疗，但有几种抗原已完成早期临床试验或正在进行临床试验。

2.1CD19 CD19属于免疫球蛋白超家族，是成熟B细胞表面多分子复合物的显性信号成分。靶向CD19治疗B淋巴细胞白血病和B细胞性淋巴瘤非常有效[12]。CD19在恶性浆细胞上表达较少，且在少量MM细胞中呈低水平表达，而MM干细胞多表达CD19[12]，MM干细胞是一种具有自我更新能力和耐药性的肿瘤细胞[13]，CD19可作为MM治疗的可靠靶抗原。Garfall等[14]的研究(NCT02135406)评价了抗CD19 CAR-T(CTL019)治疗复发难治性MM(relapsed or treatment-refractory multiple myeloma，RRMM)的效果，结果发现，给予高剂量Melphalan和自体造血干细胞移植后，患者药物耐受良好且病情缓解。

CD19 CAR-T也可与BCMA CAR-T联合使用。徐州医科大学附属医院开展了一项单中心、单臂Ⅱ期临床试验，选取21例RRMM患者行CD19 CAR-T联合BCMA CAR-T治疗，在179 d的中位随访时间中，20例患者总体缓解，包括9例严格意义的完全缓解、3例完全缓解、5例非常好的部分缓解和3例部分缓解，证实CD19联合BCMA CAR-T用于RRMM治疗的可行性[15]，但其初始治疗值需要在随机试验中进一步确认。

2.2CD38 CD38又称环腺苷二磷酸核糖水解酶，是一种存在于多种免疫细胞表面的跨膜糖蛋白，参与细胞的黏附、信号转导和钙调控[16]。CD38通常在B细胞、浆细胞、T细胞、自然杀伤细胞以及骨髓前体细胞表达，也在髓系前体细胞、前列腺细胞、肌肉细胞、破骨细胞以及其他细胞表达[17]。以上细胞与正常造血细胞相比CD38表达水平更高，因此被用于MM细胞的检测[18]。CD38在骨髓瘤细胞和健康造血细胞中均表达，这增加了肿瘤靶向/非靶向毒性的风险[19]。基于免疫治疗的方法中，两种针对MM细胞CD38的单克隆抗体Daratumumab和Isatuximab已经在临床上进行了测试，显示能显著改善复发性或难治性MM患者的预后，也能改变新诊断患者的前期治疗前景[20]。Daratumumab作为单药，治疗难治性骨髓瘤的缓解率为36%[21]。早期的临床前研究显示，虽然靶向CD38的CAR-T增殖并产生细胞因子，并最终溶解CD38+MM细胞，但由于溶解CD38-骨髓瘤细胞的脱靶效应，毒性风险无法消除[22]。有研究采用亲和力优化技术，利用轻链交换产生抗CD38抗体，该抗体与CD38的结合亲和力与Daratumumab相似，CD38嵌合抗原受体转导的T细胞也能溶解CD34+造血祖细胞、单核细胞、自然杀伤细胞的CD38+部分，并在较小程度上溶解T细胞和B细胞，但不抑制祖细胞向各种髓系的生长，且都可以被基于Caspase-9的自杀基因有效控制[21]。因此，有研究在Caspase-9的基础上结合自杀基因改变CAR的结构，以消除CAR-T的毒性[23]。近年，CD38靶向的CAR-T已被用作复发性或难治性MM患者的单一治疗(NCT03464916)[24]，部分临床试验正在探索CD38靶向CAR-T与其他靶抗原的组合，包括CD19(NCT03125577)和BCMA(NCT03767751)[23-24]。

2.3CD138 CD138是一种黏附分子，与细胞外基质的分子胶原和纤维连接蛋白结合，促进细胞增殖[25]。该蛋白还介导细胞黏附、细胞信号转导，参与不同阶段的癌发生相关，如肿瘤细胞的增殖、转移、侵袭以及血管生成，一般成熟上皮细胞、部分恶性浆细胞及正常细胞均有CD138表达，但正常T细胞和B细胞不表达CD138[26]。复发或疾病进展患者MM细胞上CD138的表达水平高于新诊断的患者[27]。近年有研究将一种名为BT062(indatuximab)的抗CD138抗体-药物偶联物用于32例重度MM患者的治疗，治疗后75%的患者病情稳定，BT062联合来那度胺治疗的总有效率为83%[28]。研究显示，抗CD138 CAR-T在体内外均对MM细胞有显著的抗肿瘤毒性作用。解放军总医院首次将抗CD138 CAR-T用于人体试验研究(NCT01886976)，对5例RRMM患者进行了化疗和干细胞移植预处理，结果显示4例患者病情稳定持续3个月以上，1例晚期浆细胞白血病患者外周血MM细胞从10.5%降至低于3%[29]。该研究的样本量较小(n=5)，因此结果可能不足以进行有意义的解释，但可接受的安全性和有限的抗肿瘤活性为进一步研究奠定了基础。刘宇等[30]构建了靶向CD138的第4代CAR-T(CD138-BBZ-7×19)，结果发现该细胞在体外的生物学功能优于第2代CAR-T(CD138-BBZ)，且在MM动物模型中具有明显的抗肿瘤作用。尽管CD138作为MM的治疗靶点具有一定价值，但CD138 CAR-T从恶性细胞脱落是一个潜在的缺陷。避免皮肤毒性和潜在的联合治疗是未来需要深入研究的方向。

2.4SLAMF7 SLAMF7也被称为CD319，由SLAMF7基因编码[31]。SLAMF7广泛表达于浆细胞、正常B细胞和T细胞亚群、自然杀伤细胞、单核细胞、树突状细胞，是单克隆抗体的治疗靶点。SLAMF7高表达于95%以上的MM细胞，不仅参与MM细胞的存活、增殖，还参与免疫细胞的调控，表达可能不受疾病阶段的影响[32]。靶向于SLAMF7的CAR-T已经显示出了很好的临床前活性。埃罗妥珠单抗是与SLAMF7结合的人源化单克隆抗体，与来那度胺联合可使RRMM患者客观缓解率大于90%；此外，埃罗妥珠单抗治疗还延长了MM患者的无进展生存期[33]。一种新型的抗SLAMF7/BCMA双特异性CAR-T产品正在进行临床前开发，目的是增加肿瘤覆盖和克服抗原丢失。与表达单个CAR-T的细胞相比，带有单链抗体的CAR-T细胞包含两个配体结合域串联连接(一个用于SLAMF7，一个用于BCMA)，其表现出更强的活性[32]。BCMA/SLAMF7双特异性CAR-T细胞与程序性死亡受体1检查点抑制剂联合使用，可加速体内肿瘤的清除[34]。

2.5κ轻链 轻链亚群(κ或λ)可在成熟B细胞上表达，针对其可进行靶向免疫治疗。在MM患者中，一个特定的轻链子集可以靶向MM肿瘤细胞。虽然不是所有浆细胞都表达细胞表面免疫球蛋白，但MM干细胞上可能有免疫球蛋白表达[35]。Vera等[36]于2006年构建了第1个κ轻链CAR-T(κ.CAR-T)，其目的是在不损害体液免疫的情况下靶向B细胞恶性肿瘤。Hutchinson等[37]以κ轻链为靶抗原进行研究发现，κ轻链对正常B细胞功能抑制作用较轻，不仅减少了低丙种球蛋白血症的发生，对体液免疫的抑制作用也较弱。成熟B淋巴细胞、成熟B淋巴样恶性肿瘤细胞和骨髓瘤细胞只表达κ或λ轻链，因此针对κ轻链可防止B细胞完全消融。Ramos等[38]使用第2代κ.CAR-T进行了一项Ⅰ期临床试验(NCT00881920)，7例MM患者接受环磷酰胺治疗后注入κ.CAR-T，治疗后4例患者病情稳定，持续时间2～17个月，但3例患者治疗无反应。另外，κ轻链免疫球蛋白分泌到血液中，降低了在MM细胞上的表达，限制了CAR-T治疗的作用[38]。

2.6BCMA BCMA属于肿瘤坏死因子受体超家族，通过与肿瘤微环境中的B细胞活化因子和增殖诱导配体结合，阻止MM细胞凋亡[39]。BCMA表达于MM细胞、恶性浆细胞表面，基本不表达于记忆B细胞、幼稚B细胞、CD34+造血干细胞等其他正常组织细胞[39]。BCMA具有显著的靶向潜能以及更少的靶向肿瘤毒性，并且在CAR-T的扩增中减少了抗原依赖性，但其潜在的缺点是可溶性BCMA可以从肿瘤释放或脱落到周围组织并进入循环[40]。BCMA的表达水平随着MM病程进展而升高[39]，此表达特征使BCMA成为MM免疫治疗的理想靶点。美国国家癌症研究所进行了BCMA靶向CAR-T的第1个临床试验(NCT02215967)，利用小鼠ScFv、信号域CD3ζ和共刺激域CD28作为抗BCMA CAR-T的组成部分，结果显示使用最小剂量的CAR-T[(0.3～3.0)×106个/kg]观察到轻微的细胞毒性，总缓解率为20%；注射最高剂量的CAR-T(9×106个/kg)具有显著的抗肿瘤功能，客观缓解率达81%，但有严重的CRS[41]。

另一项临床研究(NCT02658929)检测了由ScFv、CD3和4-1BB结构域组成的抗BCMA CAR-T(bb2121)治疗33例RRMM的效果，其中客观缓解率为85%，主要不良反应为CRS(76%)和神经毒性(42%)[42]。bb21217是继bb2121之后的新一代抗BCMA CAR-T，除体外培养时添加磷脂酰肌醇-3-激酶抑制剂bb007外，bb21217的结构与bb2121相似，这种增加记忆样表型T细胞比例的修改促使CAR-T更持久和有效[43]。bb21217 Ⅰ期剂量递增临床研究(NCT03274219)显示，7例RRMM患者用1.5×108个CAR-T处理，CAR-T细胞显著扩增，有5例患者发生CRS，包括1例3～4级脑病的剂量限制性毒性患者[43]。LCAR-B38M是一种靶向BCMA表位VHH1和VHH2的双特异性CAR-T产物。使用LCAR-B38M抗BCMA CAR-T治疗57例MM患者发现，88%的患者具有整体反应，68%的患者完全缓解，但也存在一些不良反应，包括细胞因子释放综合征、白细胞减少、血小板减少以及发热[44]。P-BCMA-101是一种靶向BCMA的CAR-T产品，包含完全人源化的抗BCMA ScFv胞外结构域、CD3ζ和4-1BB信号域。在Ⅰ期临床试验研究(NCT03288493)中评估了P-BCMA-101治疗RRMM的有效性和安全性，12例患者中有1例为完全缓解，1例发生2级细胞因子释放综合征[45]。

靶向BCMA的CAR-T治疗RRMM有效，且严重细胞因子释放综合征和神经毒性的发生率与CD19 CAR-T相似[46]。目前抗BCMA CAR-T在MM治疗方面显示出相当大的潜力，且不会引起无法控制的细胞因子释放综合征或意外毒性，但仍需要进一步研究以确定治疗反应的持久性以及最佳的CAR结构和细胞产物组成。

3 CAR-T治疗的局限性

靶向骨髓瘤相关抗原的CAR-T治疗给MM的治愈带来了新的希望。随着治疗患者数量的增加，治疗相关的毒性和疾病复发提示CAR-T治疗的局限性，包括肿瘤外毒性、抗原逃逸、非最佳激活和CAR-T治疗持久性不佳等。首先是治疗相关毒性，CAR-T治疗相关的毒性可分为两类：①因T细胞对肿瘤细胞的识别和激活以及随之而来的高水平细胞因子不受控制的释放而产生的一般毒性(对靶点、对肿瘤的毒性)；②CAR-T与正常细胞表达的靶抗原特异性结合产生的毒性(靶向、非肿瘤毒性)。其次是CAR-T治疗后复发，其中最常见的原因是肿瘤细胞的出现以及靶抗原表达缺失或下调。迄今为止，已有多个临床试验报道了BCMA CAR-T治疗后BCMA丢失或残余MM细胞BCMA表达下调[47-48]。由于接受治疗的MM患者中存在大量的肿瘤亚克隆，治疗过程中出现或已存在的BCMA低表达或BCMA阴性亚克隆更有可能发生抗原逃逸。

CAR-T临床应用的一个潜在限制是患者血清中存在可溶性蛋白抗原。靶抗原可以从细胞膜上释放进入血液循环，CAR-T可能会因为与可溶性靶抗原结合而导致功能消除。在MM中，CD138细胞外结构域可从细胞表面分离，而CAR-T通过与分离的CD138细胞外结构域结合而导致功能消除，从而导致免疫逃逸[49]。靶抗原的切割并不只针对CD138蛋白，BCMA也可以从MM细胞释放到血清中[50]。

从MM患者身上获取足够数量的T细胞以生产CAR-T可能是可行的。bb2121临床试验表明，100%接受白细胞分离的患者都能成功生成BCMA CAR-T[42]。但由于骨髓瘤患者免疫系统恶化，从中收获的T细胞质量可能是一个重要的限制因素。因此，与骨髓瘤反应相关的最可靠指标是注入CAR-T的体内扩张水平和持久性[51]。另一方面，患者的年龄、既往治疗方法和疾病本身都可能限制患者来源T细胞的数量和质量，潜在地影响CAR-T产品的效力和可变性[52-53]。

4 小 结

CAR-T是治疗MM的一种有前景的新方法，其能够杀死对标准疗法有抗性的MM细胞。目前CAR-T治疗MM正处于改进和提高阶段，今后的主要目标是改进CAR-T结构、增加CAR-T安全时效性以及管理CAR-T细胞治疗的长期并发症。首先，最大优化CAR技术主要是通过持续完善不同的共刺激、铰链和跨膜结构域以及降低CAR的免疫原性。其次，为了达到最佳的患者反应需要优化传统CAR-T，增加其安全性和有效性，并提高制造的可行性。抗原结合域的选择是CAR设计中克服可溶性蛋白对CAR-T破坏的关键因素。最后，对耐药机制的进一步研究可提高疗效的持久性，同时减少肿瘤治疗相关的毒性。目前CAR-T治疗可能会成为RRMM患者治疗的关键策略。因此，为MM靶向细胞治疗设计最优化的CAR结构，即最大程度地杀伤肿瘤细胞并避免发生细胞因子释放综合征、神经毒性等不良反应，是未来MM靶向治疗面临的主要问题。