PD-1/PD-L1抑制剂在未分化甲状腺癌中的研究进展

鲍欣，刘爽综述 张弘审校

甲状腺癌是内分泌系统恶性肿瘤中最常见的癌症类型，全球发病率迅速增长，严重威胁着国民健康[1-2]。未分化甲状腺癌(anaplastic thyroid carcinoma, ATC)是甲状腺癌中致死率最高的病理类型。ATC患者的中位生存期仅为3～6个月[3- 4]。ATC传统的治疗方法主要包括手术、放射治疗、化疗和分子靶向治疗，但疗效均欠佳。

近几年，针对免疫检查点程序性死亡受体-1(programmed death-1, PD-1)和程序性死亡-配体1/2(programmed death-ligand 1/2, PD-L1/L2)之间相互作用的免疫检查点抑制剂在PD-L1表达的肿瘤治疗中具有显著的临床疗效[5-8]。Brown等报道了PD-L1在甲状腺癌中的表达后，一系列研究证实了大多数ATC肿瘤细胞上PD-L1表达[9]。因此，PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂治疗给ATC患者带来了新的希望。

1 PD-1/PD-L1的生物结构

1.1 PD-1分子结构及表达 PD-1又称CD279，于1992年在白介素-3(interleukin-3, IL-3)缺失的LyD9(小鼠造血祖细胞)和2B4-11(小鼠T细胞杂交瘤)细胞系中首次发现。PD-1是一种在经历程序性细胞死亡的T细胞杂交瘤中上调的基因。PD-1作为CD28/B7家族成员之一，是一种相对分子质量为55 000的跨膜蛋白，由小鼠1号染色体和人类2号染色体上的Pdcd1基因编码的具有288个氨基酸的Ⅰ型跨膜蛋白。PD-1在结构上包含一个v型结构域的细胞外区、膜渗透结构域和位于N端和C端的具有2个酪氨酸碱基的细胞质尾，其中靠近N端的为位于免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif, ITIM)，靠近C端的为位于免疫受体酪氨酸转化基序(immunoreceptor tyrosine-based switch motif, ITSM)[10]。PD-1主要表达于活化的T细胞、B细胞、自然杀伤T细胞、巨噬细胞、活化的单核细胞和树突状细胞[11]。

1.2 PD-L1/PD-L2的分子结构及表达 PD-1主要有2个配体，包括PD-L1(B7-H1, CD274)和PD-L2(B7-DC, CD273)[12-13]。在结构上，PD-L1和PD-L2具有34%的同源性氨基酸。PD-L1是由小鼠第19号染色体和人类第9号染色体上的Cd274基因编码的具有290个氨基酸的Ⅰ型跨膜蛋白。PD-L1在多种实体肿瘤(乳腺癌、黑色素瘤、肺癌、卵巢癌、肝癌、甲状腺癌和结肠癌等)中表达[14]。干扰素γ(interferon-γ, IFN-γ)可上调PD-L1的表达。其机制可能为IFN-γ诱导蛋白激酶D2(protein kinase D2, PKD2)的表达从而调控PD-L1的表达。在卵巢癌细胞中IFN-γ导致PD-L1的上调是疾病进展的主要原因。IFN-γ和TLR配体通过JAK/STAT/IRF-1、MEK/ERK和MYD88/TRAF6等途径诱导PD-L1。抑制IFN-γ受体1可以通过MEK/ERK和MYD88/TRAF6通路降低急性髓系白血病小鼠模型中PD-L1的表达[15]。对黑色素瘤细胞的研究表明，T细胞通过JAK1/JAK2-STAT1/STAT2/STAT3-IRF1途径分泌的IFN-γ调节PD-L1的表达。免疫反应并不是诱导PD-L1表达的唯一途径，致癌性的c-Jun(AP-1)和STAT3及缺氧诱导因子HIF-1α转录也可上调PD-L1的表达[16-17]；肿瘤表观遗传学中的EZH2和BET4可上调PD-L1；组蛋白去乙酰化酶可下调PD-L1表达[18-20]。此外，PTEN功能的丧失和PI3K/AKT/mTOR通路的激活增加了PD-L1的转录后表达[21]。PD-L2是由Pdcd1lg2基因编码的Ⅰ型跨膜蛋白。PD-L2主要表达在树突细胞和单核细胞。PD-L2对PD-1的亲和力高于PD-L1，PD-1与PD-L2的亲和力比PD-1与PD-L1高2～6倍[21-23]。然而，由于PD-L2的低表达，PD-1与PD-L2相互作用在功能上远不如PD-1与PD-L1相互作用，而且PD-1只有在PD-L2水平非常高时才对PD-L2存在竞争的敏感性[21]。PD-1与PD-L1的结合可诱导T细胞耐受和凋亡，防止自身/同种免疫反应[24]。因此，在介导PD-1阳性淋巴细胞抗肿瘤免疫应答过程中，发挥抑制作用的主要为肿瘤细胞表面的PD-L1配体。

2 PD-1/PD-L1在肿瘤微环境中的作用机制

2.1 促使肿瘤细胞发生免疫逃逸 有效的抗肿瘤免疫反应是一个复杂的过程[25-26]。免疫系统中的T细胞必须能够识别肿瘤细胞，产生细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)。这些CTL细胞进入并渗透到肿瘤，与肿瘤细胞结合，杀伤肿瘤细胞。在肿瘤微环境中，免疫检查点PD-1/PD-L1对抗肿瘤的免疫发挥着抑制作用。肿瘤抑制宿主抗肿瘤相关的免疫反应的一个重要机制是肿瘤微环境中上调的免疫检查点PD-L1与CTL细胞上的PD-1结合，从而促进了肿瘤的生长、增殖和侵袭[27]。肿瘤细胞利用表面表达的PD-L1来逃避宿主的免疫监视，从而发生免疫逃逸。

2.2 增强调节性T细胞功能 调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)是一类具有高度免疫抑制的CD4+T细胞亚群，其在维持免疫耐受和减弱免疫反应中发挥着至关重要的作用。Tregs通过表面表达PD-1形成了一个高度免疫抑制的肿瘤环境[28]。研究发现，在CD3和TGF-β存在时，Treg细胞上表达的PD-1受体与配体的结合增加了初始CD4+T细胞向Treg细胞的转化[29]。

2.3 其他 研究表明，PD-L1除了具有促进肿瘤始发细胞的生成、肿瘤干细胞的维持、上皮细胞的间质化及肿瘤细胞的转移等功能外，还具有与化疗耐药和预后不良等相关的临床特征[30]。此外，在B细胞上阻断PD-1已被证明可以增加抗原特异性抗体的应答，这表明PD-1在抑制B细胞克隆中也发挥着重要的作用[31]。

3 PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂在ATC中的应用

第一个PD-1免疫检查点抑制剂应用于实体肿瘤的临床研究始于2006年，这引起了全世界对PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂在肿瘤治疗方面的关注。近几年来，PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂已成为肿瘤免疫治疗中有效的药物，主要包括抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体。PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂通过抑制活化的T细胞上表达的PD-1与肿瘤细胞上的PD-L1结合，阻断PD-1与PD-L1之间的相互作用，解除肿瘤微环境的免疫抑制，进而使机体的免疫系统有效的杀伤肿瘤细胞。PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂已在多种肿瘤中显示出较好的疗效，其在ATC的治疗也显现出一定的疗效。

3.1 单独应用抗PD-1/PD-L1抗体治疗ATC Capdevila等[32]开展了一项关于PD-1抑制剂应用于局部晚期和/或转移性ATC的Ⅱ期临床试验，评估了人源化抗PD-1的单克隆抗体spartalizumab治疗ATC的疗效和耐受性。42例ATC患者给予spartalizumab 400 mg，每4周1次，治疗的总反应率(overall response rate, ORR)为19%，其中3例完全缓解(complete remission, CR) (7%)、5例部分缓解(partial response, PR) (12%)。此试验结果显示，PD-L1阳性(PD-L1≥1%)患者应答率为29%，同时PD-L1阳性患者1年总生存期(overall survival,OS)达到52.1%。最常见的治疗相关不良事件是腹泻(12%)、瘙痒(12%)、疲劳(7%)和发热(7%)。该项研究中PD-1免疫检查点抑制剂在局部晚期和/或转移性ATC患者中显示了良好的抗肿瘤活性，可考虑作为PD-L1阳性ATC患者治疗的选择。同时，应用PD-1免疫检查点抑制剂的相关不良反应较为轻微，充分说明了抗PD-1/PD-L1抗体治疗ATC的安全性。

3.2 基于抗PD-1/PD-L1抗体的联合治疗

3.2.1 抗PD-1/PD-L1抗体与分子靶向治疗联合：靶向药物利用正常细胞与肿瘤细胞在酶、基因及信号转导等方面的不同，选择性抑制肿瘤细胞的生长、增殖，到达治疗肿瘤的目的。目前开展了一系列PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂与分子靶向治疗中抑制肿瘤血管生成的酪氨酸酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors, TKI)及抑制肿瘤细胞增殖的BRAF抑制剂联合治疗ATC的相关研究。

Gunda等[33]在原位ATC的新型免疫活性小鼠模型中应用PD-1/PD-L1抑制剂联合多靶点酪氨酸激酶抑制剂Lenvatinib。Lenvatinib单药治疗增加了肿瘤内浸润的巨噬细胞、CD8+T细胞、Treg、多形核骨髓源性抑制细胞(数量增加与治疗中产生的耐药性密切相关)。PD-1/PD-L1抑制剂联合多靶点酪氨酸激酶抑制剂使CD8+T细胞进一步增加，同时联合治疗降低了多形核骨髓源性抑制细胞。联合治疗使荷瘤小鼠的肿瘤明显缩小，显著提高了荷瘤小鼠的总体生存率。PD-1/PD-L1抑制剂联合多靶点酪氨酸激酶抑制剂在小鼠ATC中显现出显著疗效。Iyer等[34]开展了一项在酪氨酸激酶抑制剂治疗ATC进展时给予抗PD-1抗体Pembrolizumab联合激酶抑制剂治疗的临床试验，12例ATC患者中PR 5例，疾病稳定(stable disease, SD)4例，疾病进展(progressive disease, PD)3例，9例患者达到临床获益(PR+SD)。此研究中大多数ATC患者在疾病进展时，酪氨酸激酶抑制剂中加入抗PD-1抗体获得了临床益处。为此，基于抗PD-1抗体治疗的联合治疗可以作为激酶抑制剂治疗ATC患者进展情况下的一种安全有效的挽救性措施。目前，一项应用酪氨酸激酶抑制剂Lenvatinib联合Pembrolizumab治疗局部晚期和不可切除或转移性ATC的Ⅱ期临床试验(NCT04171622)正在进行中[35]。此项研究的目的是为了验证Lenvatinib联合Pembrolizumab在治疗初发ATC患者中的有效性。

一项关于BRAF抑制剂和抗PD-L1抗体联合治疗小鼠ATC的实验中[36]，在2周时与单独使用BRAF抑制剂PLX4720(439.3 mm3±188.4 mm3,P=0.023)或抗PD-L1抗体(716.7 mm3±62.1 mm3,P=0.001)比较，联合治疗使肿瘤体积显著减小(147.3 mm3±60.8 mm3)。同时，与单独治疗相比，联合治疗增加了肿瘤内的CD8+CTL的浸润和CD8+T与Treg的比率。此实验表明,抗PD-1/PD-L1抗体与BRAF抑制剂联合治疗可显著改善ATC荷瘤小鼠的免疫功能，增强抗肿瘤免疫和肿瘤的消退。另一项关于BRAF抑制剂和抗PD-1抗体/抗PD-L1抗体联合治疗小鼠原位ATC的实验中[37]，与单独应用PLX4720(259 mm3±65 mm3, 肿瘤抑制率41%)相比，PLX4720+抗PD-1抗体(160 mm3±47 mm3, 肿瘤抑制率61%)及PLX4720+抗PD-L1抗体(170 mm3±67 mm3, 肿瘤抑制率64%)可显著抑制肿瘤增长。PLX4720+抗PD-1抗体组[(28.0±2.5)d ]及PLX4720+抗PD-L1抗体组[(28.0±0.9) d ]小鼠的中位生存时间显著长于对照组[(13.0±0.5) d]。此项研究表明,联合治疗显著增加了肿瘤内CD8+T细胞数量和细胞毒性,以及增加了肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage, TAM)向M1的极化和减少骨髓源性抑制细胞。因此，抗PD-1/PD-L1抗体与BRAF抑制剂的联合治疗可提高荷ATC肿瘤小鼠的生存率和抗肿瘤的免疫能力。

Wang等[38]报道了1例BRAF V600E基因突变的有远处转移无法行手术切除的ATC患者应用BRAF抑制剂dabrafenib和trametinib(DT方案)联合抗PD-1抗体Pembrolizumab(DTP方案)进行治疗。患者在接受5个疗程治疗后，颈部肿物显著减小，吞咽及呼吸困难等症状改善，成功完成了甲状腺全切除术和中央颈部清扫术。BRAF基因位于7q34染色体上，调控细胞生长、分化和凋亡等。突变后的BRAF基因活性比突变前提高上百倍，导致细胞异常分化、增殖。在ATC患者中约有45%的患者存在BRAF基因的突变。为此，PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂联合BRAF抑制剂可为局部进展或转移性晚期ATC的治疗提供新的选择。

3.2.2 抗PD-1/PD-L1抗体与放化疗的联合：在一项关于抗PD-1抗体Pembrolizumab联合放化疗作为不可切除ATC的初始治疗的Ⅱ期临床研究(NCT03211117)中[39]，3例ATC患者在接受放化疗加Pembrolizumab治疗后颈部肿瘤减小。这种联合治疗潜在的作用机制为放疗可诱导肿瘤细胞的免疫原性死亡，释放的肿瘤抗原通过抗原提呈细胞递呈给肿瘤抗原的特异性T淋巴细胞，使其活化、增殖为CTL。CTL上高表达的PD-1抑制其杀伤肿瘤的功能，抗PD-1抗体可有效解除PD-1对CTL的免疫抑制。为此，PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂与放射治疗联合具有协同作用。

3.2.3 抗PD-1/PD-L1抗体与T细胞共刺激分子激动剂的联合：一项Ⅰb期的临床研究应用抗PD-1抗体Pembrolizumab和T细胞共刺激分子4-1BB激动剂Utomilumab在实体肿瘤患者中验证其安全性和早期有效性。该研究中包括2例ATC患者，经过治疗其中1例ATC患者达到PR。4-1BB激动剂促使T细胞激活和细胞因子产生(如IFN-γ)，可诱导肿瘤细胞上PD-1或肿瘤微环境中其他免疫细胞上PD-L1的表达增加。4-1BB激动剂与PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂的联合在抗肿瘤免疫反应中起到协同抗肿瘤作用[40]。PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂和T细胞共刺激激动剂对ATC患者治疗的成功最终将取决于患者固有的抗肿瘤T细胞的反应。

4 总结与展望

因ATC的去分化表型和高度的侵袭性，其治疗在临床上仍然是一个巨大的挑战。在临床上很多患者在确诊ATC时已无法行手术切除，且放化疗的疗效并不理想。一般情况下ATC对放射性131I治疗也不敏感。为此，寻求有效治疗ATC的方法迫在眉睫。越来越多的证据表明PD-1及其配体是T细胞激活和诱导及维持外周免疫耐受的关键调控因子。PD-1通路在自身免疫、移植免疫、感染及肿瘤免疫的调控中发挥着重要的作用。在基础和临床研究中，越来越多的研究者总结了PD-1/PD-L1抑制剂在多种肿瘤治疗中持久而稳定的抗肿瘤作用。然而研究中发现一部分患者对PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂治疗无效。在应用PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂治疗前通过免疫成像技术检测ATC患者体内CD8+T细胞的阳性成像可预测治疗的阳性反应。充分地研究PD-1/PD-L1在ATC发生、发展中的作用，在临床上可有效地指导ATC的治疗。基于PD-1/PD-L1抑制剂的联合治疗，包括单抗+单抗、单抗+化疗、单抗+放疗、单抗+分子靶向治疗等在ATC的治疗上是极具希望的，然而，还需要大规模的临床试验来更好地评估其有效率和长期疗效。细胞间黏附分子1被确定为ATC中一个潜在的嵌合抗原受体T(chimeric antigen receptor-T, CAR-T)细胞靶点[41-42]，未来可将CAR-T细胞疗法联合PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂用于ATC的治疗，给ATC患者带来新的希望。