MicroRNAs在特发性肺纤维化中的作用研究进展

徐文豪，李万成 (.成都市第一人民医院，四川 成都 60000；.成都医学院第一附属医院，四川 成都 60000)

MicroRNAs(miRNAs)是真核生物中一类长度约20～24个核苷酸的功能性非编码单链小RNA,是由具有发夹结构的约70～90个碱基组成的pre-miRNA经过Dicer酶剪切产生,miRNAs与目标 mRNA 的 3'非编码区(3'URT)相结合,抑制翻译过程或降解目标mRNA,从而抑制相关基因的表达,具有调节多细胞多种生物学功能的作用[1-3]。一个miRNA可以作用于多个靶点，多个miRNA也可以共同调控一个基因的表达[4]。

特发性肺纤维化(IPF)是一种慢性、进展性、纤维性间质性肺疾病,病变部位局限于肺部,其肺组织学和胸部高分辨率CT表现与一般间质性肺炎相似。IPF的病理生理机制是各种原因导致肺泡上皮细胞破坏，从而引起趋化因子、蛋白酶、TGF-β等导致纤维化的细胞因子释放,成纤维细胞和肌成纤维细胞激活、聚集,肺泡上皮细胞向间质转化，细胞外基质大量沉积,最终肺实质破坏、被纤维组织替代,引起呼吸衰竭,确诊后中位生存期为3至5年[5]。肺纤维化发病率、患病率以及死亡率正逐年上涨[6]。

目前肺纤维化的机制尚不十分明确，许多研究表明miRNAs在IPF的发病过程中起重要作用。miR-21在IPF模型小鼠肺组织和IPF患者的肺中显著上调，miR-21参与了肺的纤维化过程[7]。Yang等[8]发现在IPF模型小鼠和IPF患者成纤维细胞中miR-31的表达减少,而将miR-31引入肺内可显著减轻模型鼠的肺纤维化,表明miR-31c是IPF发病机制中的重要调节因子,可能成为治疗IPF患者的潜在靶点。

近年来研究表明microRNAs(miRNAs)在IPF的发生发展中起重要作用,参与了肺纤维化过程中的肺上皮修复、上皮-间充质转化(EMT)、成纤维细胞活化、肌成纤维细胞分化、巨噬细胞极化、肺泡上皮细胞(AECs)衰老和胶原生成。miRNA表达中的长非编码RNA(LncRNAs)和miRNAs之间的相互作用以及miRNA与DNA甲基化的相互作用在IPF过程中起重要调控作用。本文就miRNAs在IPF中的作用的最新研究进展作一系统综述。本次研究经过本院医学伦理委员会同意。

1 miRNAs与肺上皮修复

AEC损伤后本应该由上皮细胞更频繁的增殖从而修复损伤，但上皮细胞的增殖是有限度的，频繁损伤或大的损伤后上皮细胞增殖不够，从而成纤维细胞会参与异常修复的过程，从而导致肺纤维化。而这种过度的损伤将会导致的上皮修复不良负反馈激活成纤维细胞产生大量细胞外基质[9]。研究表明,IPF患者AECs中miR-29c表达下调,IPF动物模型AECs中的miR29c表达降低导致细胞凋亡增加,上皮更新减少,而miR-29c过表达作用于Foxo3a靶点导致AECs大量增殖、存活率提高,从而使体内纤维化减少[10]。Ge等[11]的研究发现，miR-323a-3p在IPF患者的AECs中比对照组降低12.5倍，博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠肺上皮细胞miR-323A-3p的表达也下降，使用miR-323a-3p模拟物可以抑制小鼠肺纤维化,而使用miR-323A-3p的拮抗剂可以促进肺纤维化，而这一过程可能是miR-323a-3p作用于Smad2减弱转化生长因子(TGF)-β信号以及抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3mRNA的表达有关。有证据表明,在IPF发展过程中,AECs中的miR-30a表达下降,而人为上调miR-30a可抑制依赖DRP-1的线粒体分裂而抑制AECs-Ⅱ凋亡,miR-30a可以通过碱基配对和3'非翻译区的互补位点来调节DRP-1启动子的羟甲基化，从而抑制TET1的表达，最终抑制肺纤维化[12-13]。

2miRNAs与EMT

EMT参与了胸膜间皮细胞(PMC)的迁移和胸膜下肺纤维化的形成,在博莱霉素处理的PMC中miR-18a-5p的表达下调,PMC的EMT增加,进一步研究表明,IPF模型小鼠中miR-18a-5p过度表达,作用于TGF-β受体Ⅱ的3'UTR区阻止博莱霉素诱导的PMC的EMT，从而抑制博莱霉素诱导的胸膜下纤维化[14]。有证据表明,miR-200家族(miR-200a、miR-200b和miR-200c)过表达,可抑制TGF-β1诱导的EMT,并且可以逆转特发性肺纤维化的病理过程[15]。Yamada等[16]人报道，在IPF的发展过程中，miR-21在肺上皮细胞中的表达上调促进了EMT的发生。HMGA2是EMT过程中的一个关键因素,Liang等[17]的研究表明,IPF模型小鼠中miR26a的表达下调作用于HMGA2可以促进EMT过程。Wang等[18]的研究也表明，miR-221靶向作用于HMGA2,通过调节TGF-β1/Smad3诱导的EMT可抑制博莱霉素诱导的肺纤维化。

3 miRNAs与成纤维细胞活化

研究表明，miR-27b过表达通过靶向作用于TGF-β受体1和Smad3,减少胶原和α-平滑肌肌动蛋白的表达,从而减轻肺纤维化[19]。miR-29在成纤维细胞抵抗凋亡的机制中被认为是细胞外基质(ECM)的调节因子。通过对转染miR-29c模拟物和miR-29c抑制剂的研究表明，TGF-β可下调miR-29c和Fas受体的表达，抵抗细胞凋亡[20-12]。研究证实，在特发性肺纤维化发生发展过程中，miR-29a的下调导致LOXL2和SERPINH1的过度表达[22]。因此上调miR-29不但可以抑制细胞外基质分泌,而且可以恢复肺成纤维细胞对凋亡的敏感性,从而减少肺纤维化。

4 miRNAs与肌成纤维细胞分化

Cui等[23]研究表明，与对照组相比，在肺纤维化患者的肺成纤维细胞中TGF-β1诱导的miR-27A-3p表达降低,miR-27A-3p的过表达抑制肺成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化,而敲除miR-27A-3p后肌成纤维细胞表型标志物α平滑肌肌动蛋白表达增加,Smad2和Smad4作用增强,从而促进成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化。Yang等[24]发现在TGF-β诱导的肺成纤维细胞和IPF患者的肺组织中,miR145表达上调，在肺成纤维细胞中转染miR145模拟物可促进α-平滑肌肌动蛋白的表达,并促进局灶性粘连和纤维性粘连的形成，进成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化，然而,miR-145表达阴性的小鼠不易被博莱霉素诱导为肺纤维化。由此可见，miR-27A-3p和miR-145可能通过促进成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，从而促进肺纤维化。

5 miRNAs和巨噬细胞

巨噬细胞极化在人类疾病的发病机制中起着重要作用,而巨噬细胞极化受多种转录因子调控,STAT1负责M1极化,STAT6负责M2激活,IL-4和IL-13通过激活STAT6通路从而促进M2极化[25]。IL-4和IL-13可诱导巨噬细胞上调miR-142-5p的表达，通过靶向STAT6磷酸化的负调控因子SOCS1，从而延长STAT6磷酸化，IL-4和IL-13可诱导巨噬细胞下调miR-130a-3p的表达，解除其对PPARγ的抑制,从而协调STAT6信号转导。抑制miR-142-5p和增加miR-130a-3p可调节巨噬细胞促纤维化的能力,从而抑制博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化[26]。

6 miRNAs与细胞衰老

研究表明,细胞衰老在IPF的发生发展中起着重要作用。AEC衰老的机制以及AEC衰老在IPF病理中的作用尚不清楚。有证据表明miR-34a、miR-34b和miR-34c可能是与细胞衰老有关,这些miRNAs在IPF患者的Ⅱ型AECs中显著上调。另一份研究表明,miR-34a在人和小鼠肺成纤维细胞中都显著上调,并且miR-34a基因敲除后会比野生型动物发生更严重的肺纤维化[27]。有趣的是，肺成纤维细胞中miR-34a的增加导致肺成纤维细胞的衰老表型，因为miRNA促进衰老标志物的表达，激活β半乳糖苷酶活性，并抑制细胞增殖。综上所述，紊乱的miR-34a通过负反馈机制促进肺成纤维细胞的衰老，从而在IPF的发病机制中抑制肺纤维化过程[28]。

7 miRNA和TGF-β1信号转导

研究表明TGF-β1可促进上皮间质转化、成纤维细胞激活聚集,细胞外基质沉积最终导致肺纤维化,TGF-β1信号通路是介导肺纤维化的关键因素[29]。在肺纤维化模型中，TGF-β1诱导WISP1表达，miR-92a可逆转TGF-β1诱导的WISP1表达，而miR-92a基因敲除可增加WISP1的表达，表明miR-92a可通过调节TGF-β1诱导的WISP1在肺纤维化中的表达，从而影响肺纤维华，这将有助于我们寻找新的IPF诊断和治疗靶点[30]。Das等[31]发现，miR-326可以调节TGF-β1的表达，并且在肺纤维化中miR-326的水平与TGF-β1的蛋白水平呈负相关，转染miR326模拟物可以抑制TGF-β1的表达,减轻肺纤维化,提示该miRNA对肺纤维化的发生、发展有一定的调节作用。此外,miR-326还可以直接下调促纤维化基因Ets1、Smad3和基质金属蛋白酶(MMP)9,而上调抗纤维化基因Smad7。

8 miRNA和胶原的产生

IPF的特征是成纤维细胞异常增生,过度分泌Ⅰ型胶原沉积在肺泡壁,从而影响肺泡细胞的通气功能,引起呼吸功能障碍。Hansen等[32]发现IPF中miR-29c的表达减少,而Ⅰ型胶原的表达增加,表明miR-29c可能通过影响Ⅰ型胶原而影响IPF的发病。Khalil等[33]进一步研究表明,IPF成纤维细胞中蛋白磷酸酶(PP)2A的功能异常低下,导致组蛋白脱乙酰化酶(HDA)C4磷酸化,miR-29c降低,而过表达HDAC4可以恢复miR-29c的水平,并抑制Ⅰ型胶原的产生。

9 miRNA表达的调控机制

长非编码RNA(Long Non-Coding RNAs，LncRNAs)影响miRNA的表达。lncRNAs广泛分布于哺乳动物体内，是一类具有200多个碱基的RNA分子，其功能类似于RNA，几乎没有蛋白质编码能力[34]。大多数lncRNAs是由RNA聚合酶II催化的，但它们的序列保守性较差，在组织和细胞中具有很强的特异性[35]。最近的研究表明,lncRNAa参与了许多重要的调控过程,如基因组印迹、染色质修饰、X染色体沉默、转录激活、转录干扰和核转运,这些调控作用也引起了广泛的关注。有证据表明,lncRNAs在多个水平上参与细胞分化和个体发育调节,并与人类疾病密切相关,但目前尚不清楚lncRNAs是否参与IPF[36]。Huang等[37]利用IPF中表达异常的miRNAs,包括let-7d、miR-21、miR-29、miR-31、miR-101和miR-199,共鉴定出34个与这些miRNAs具有潜在结合位点的lncRNA,其中4个lncRNAs与这些紊乱的miRNAs呈负相关,沉默lncRNA CD99P1可抑制肺成纤维细胞增殖和α-平滑肌肌动蛋白的表达,敲除lncRNAn341773可以增加肺成纤维细胞胶原表达,以上发现提示CD99P1和n341773参与了IPF的发病机制,lncRNAs和miRNAs的相互作用在IPF的发病机制中起重要作用,是IPF发病机制研究的新方向。

miRNA之间相互作用影响miRNA的表达。每个miRNA可以有多个靶基因，多个miRNA也可以调控同一个基因。这个复杂的调控网络可以是几个miRNA的组合来精细调控一个基因的表达，也可以通过miRNA之间的相互调控来从而影响疾病的病理过程。Liang等[38]发现，Lin28B通过抑制Let-7d促进EMT，而抑制LIN28B则可以抑制TGF-β1诱导的肺纤维化和EMT。有趣的是，Lin28B是miR-26a的直接靶标之一，增加miR-26a可以通过抑制Lin28B而从而增强let-7d的表达，表明Lin28B介导了miR-26a对let-7d的调控作用。本研究提出了一种新的miRNA调控途径，即一种miRNA与另一种miRNA相互作用可影响IPF的发病机制。

miRNAs和DNA甲基化的相互作用影响miRNA的表达。miRNA启动子可能存在于DNA甲基化位点,miRNAs也可能通过抑制DNA甲基转移酶(DNMT)参与DNA甲基化机制。在IPF患者的肺活检和肺成纤维细胞中,miR-17～92的表达明显低于对照组，而miR-17～92启动子的DNMT 1表达和甲基化程度显著高于对照组。结合其他数据，可以肯定在肺纤维化中，miR-17～92和DNMT 1之间存在一个新的表观遗传反馈环[39]。

10 结论与展望

miRNAs在IPF的发病机制中也发挥着重要作用。许多研究表明miRNA模拟物或抑制剂对多种人类疾病具有治疗效果。不幸的是双链RNA稳定性很差，极易被RNase等酶修饰失去治疗作用。一些核酸药物由于特定的分子机制,如天然免疫反应的激活,目前也无法用于临床治疗。最近,Yamaada等[40]开发了一种新型的miR-29b模拟物,它类似于“PNK-RNA”和“PSH-RNA”，并且这种新颖的RNA平台结构不仅可以适用于miR-29b，而且可以适用于所有的miRNAs。这种新型的模拟RNA“miR-29b PSH-Match”对博莱霉素诱导的小鼠肺间质纤维化有明显的治疗作用，吸入miR-29b PSH-Match可用于IPF患者的治疗。这种新型miRNA药物的出现有着极其重要的价值，通过人们对miRNA的进步一步研究，miRNA药物可能为治疗IPF最有效的方式。

对部分miRNAs的研究表明,miRNAs参与了生命过程中的一系列重要过程,包括细胞增殖、凋亡、细胞死亡、脂肪代谢和细胞分化。根据我们的综述,miRNAs在IPF患者的血液和肺组织中差异表达,并与IPF的发病机制密切相关。此外,miRNAs被证实参与IPF的病理机制,如肺上皮修复、EMT、成纤维细胞激活、肌成纤维细胞分化、巨噬细胞极化、AEC衰老和胶原生成等。此外,在IPF的病理过程中,许多因素被认为是miRNA异常表达的调节器。这些调节因子可以通过影响特异性miRNAs的表达来影响IPF的发病。这些发现提示miRNAs可能是IPF的诊断和治疗靶点,也是IPF疾病预后的指标。miRNAs可能成为一种全新的治疗IPF疾病的方法。