胶原蛋白肽对男性头发质量及HaCaT细胞增殖的影响

刘利格，闫 征，宋 萃，李志国，刘爱青，王海燕

（1.北京盛美诺生物技术有限公司，北京 100062；2.北京电子科技职业学院生物工程学院食品技术系，北京 100176）

胶原蛋白肽（collagen peptide）直接影响皮肤细胞代谢，可促进胞外基质蛋白如成纤维蛋白、弹性蛋白和糖蛋白的合成，并通过诱导调节T细胞和巨噬细胞增强皮肤逆转，对于改善皮肤健康具有积极影响[1，2]。头发同为皮肤的附属器，目前多数研究注重关注外部局部应用胶原蛋白产品对头发产生的影响，而对口服胶原蛋白肽对头发的影响缺乏系统研究。一项研究报道灌胃和皮肤涂抹胶原蛋白肽的小鼠，血液和皮肤中的羟脯氨酸含量接近，两种补充方式均利于促进小鼠毛发生长，提高毛发质量，使毛发更光滑更有光泽[3]。同样，一项交叉研究也表明胶原蛋白肽能够改善头发干枯，提升头发色泽[4]。毛发的循环和毛囊再生是表皮与真皮层之间多种信号分子参与的过程，是多种细胞因子等生物活性蛋白相互作用的过程，生长因子是参与调控毛发生长循环启动和停止的关键分子[5]。人永生化表皮细胞属于成人表皮细胞（HaCaT细胞）自发转化而来的细胞系，与人体正常的角质形成细胞有相同的增殖、分化特性和遗传稳定性[6]。体外培养的HaCaT细胞分泌的表皮生长因子（EGF）能促进角阮细胞的迁移和增殖，促进毛囊和汗腺细胞的增殖，正常水平的EGF生能刺激表皮基底层和外毛根鞘的生理性生长[7]。因此研究者常利用HaCaT细胞来进行毛发再生的体外功效研究。本研究旨在分析口服胶原蛋白肽对男性头发直径和脱落根数的影响，并初步研究了胶原蛋白肽对HaCaT细胞增殖和EGF合成的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取47名男性受试者为本研究对象。纳入标准：年龄30～40岁；中轻度脱发者；Hamilton分级为Ⅰ～Ⅳ型；无基础疾病；试验前1个月无其他相关用药史；未参加其他临床试验。排除标准：受试物及相关物过敏者。采用随机数字表法分为试验组26名和安慰剂组21名。试验组年龄30～40岁，平均年龄（35.12±3.61）岁。安慰剂组年龄30～40岁，平均年龄（34.38±3.32）岁。两组年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），研究可比。本研究所有受试者知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 试验方法 两组受试者分别给予胶原蛋白肽（安徽盛美诺生物技术有限公司）6 g和麦芽糊精（山东西王糖业有限公司）6 g，按要求溶于水，分早晚2次服用，连续服用5个月。分别在第1周末和第1、2、3、4、5月末对受试者进行电话随访，研究其对产品的依从性和耐受性。

1.2.2 细胞培养 使用完全培养基（10%FBS+RPMI-1640+双抗）在10 cm细胞培养皿中培养HaCaT细胞，待细胞密度增殖至90%时进行传代；0.25%胰酶室温消化，将计数后的细胞按照（1～2）×105密度接种至新的细胞培养皿中，置于37 ℃，5% CO2培养箱内继续培养。

1.3 观察指标 比较两组头发直径、头发脱离根数、不同型号胶原蛋白肽对HaCaT细胞增殖的影响。

1.3.1 头发直径 从每位受试者左颞侧区域选取20根剪取近头皮处头发1段约1 cm，测量头发直径。

1.3.2 头发脱离根数 在服用前1周和服用后1周，按要求1周内洗头2次，洗头后第2天进行梳发试验（由前向后梳30次，记录脱落头发根数，取两次均值即为头发脱落根数）[8]。

1.3.3 不同型号胶原蛋白肽对HaCaT细胞增殖的影响 按2×104/ml细胞数铺至六孔板中，密度约70%；加入不同浓度胶原蛋白肽：CP-01（鱼来源胶原蛋白肽，平均分质量约500 Da，产品型号CP-01，盛美诺）、CF-1000（鱼来源胶原蛋白肽，平均分质量约1000 Da，产品型号CF-1000-S-02，盛美诺）、CF-2000（鱼来源胶原蛋白肽，平均分质量约2000 Da，产品型号CF-2000-S-02，盛美诺）溶液，于37 ℃、5% CO2培养箱内继续培养12 h；CCK8检测细胞活力，蛋白提取和Western blotting。

1.3.4 细胞因子EGF的表达将多肽处理后细胞和对照孔细胞加入0.25%胰酶消化，收集细胞，加入200 μl RIPA细胞裂解液重悬细胞，离心后取上清作为待测样品。BCA法蛋白定量，调整蛋白浓度，加入5×还原样品缓冲液后样品终浓度为1 mg/ml，煮沸变性后用10%分离胶和5%浓缩胶分离转膜，山羊抗鼠、兔抗体检测EGF。

1.4 统计学方法 采用OriginPro 8统计学软件进行分析和作图，计量资料以（±s）表示，行t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组头发直径比较 试验组服用后头发直径大于安慰剂组（P＜0.05），见表1。

表1 两组头发直径比较（ ，μm）

2.2 两组头发脱落根数比较 试验组服用后头发脱落根数少于安慰剂组（P＜0.05），见表2。

表2 两组头发脱落根数比较（ ，根）

2.3 胶原蛋白肽对HaCaT细胞活力及EGF合成的影响 胶原蛋白肽CP-01对HaCaT细胞具有增殖作用，浓度为25 mg/ml时效果最佳，见图1。对比其他型号胶原蛋白肽对HaCaT细胞增殖活性，胶原蛋白肽CP-01（鱼来源平均分子量约500 Da）、CF-1000（鱼来源平均分子量约1000 Da）和CF-2000（鱼来源平均分子量约2000 Da）对HaCaT细胞增殖提高的最适浓度分别为25.0μg/ml、25.0μg/ml和100μg/ml，见表3。

表3 不同浓度胶原蛋白肽对HaCaT细胞活力的影响（%）

图1 不同浓度的胶原蛋白肽对HaCaT细胞活力的影响

2.4 细胞因子EGF的表达 以 β-actin作为内参，Western blot结果显示，与对照组相比，添加不同浓度的三种胶原蛋白肽，EGF相对灰度均有不同程度地增加，即各胶原蛋白肽对HaCaT细胞中EGF表达均具有一定上调作用，其中CP-01在较低浓度6.25 μg/ml和12.5 μg/ml两个浓度时，EGF的相对灰度较大；CF-1000在25 μg/ml时EGF相对灰度较大；CF-2000在100 μg/ml时相对灰度最大，见图2。不同胶原蛋白肽对HaCaT细胞及其合成EGF水平的促进作用可能与分子量有关。

图2 CP-01、CF-1000及CF-2000对HaCaT细胞中EGF表达的影响

3 讨论

胶原蛋白中存在能引起机体生物学效应的活性肽，如抗氧化肽、抗菌肽、生长因子肽、免疫因子肽等。胶原蛋白肽是通过限制酶切技术产生的活性肽，分子量远小于蛋白质，易溶解、低粘度、抗凝胶形成，在体内以多肽形式被吸收转运至靶器官，生物利用率高，具有营养强化作用。不同的酶切技术，得到的胶原肽生物学活性存在差异。脱发和头发生长出现问题的原因主要包括油脂分泌过多、头皮屑增加、头皮炎症等头皮微生态失衡，以及毛囊生长受到抑制等问题，改善这些问题就有可能在一定程度上改善脱发和头发生长问题[9]。胶原蛋白肽改善皮肤水油平衡、皮肤炎症，可为头发生长提供较好的微环境。胶原蛋白肽干预可改善老化皮肤胶原蛋白断裂，使皮肤分层明显，胶原纤维和附属器排列更为整齐，使真皮胶原厚度增加，抑制表皮局部增厚[10]。毛囊周期性生长，毛发周期性脱落，是由上皮细胞和下面的真皮细胞相互作用、激素调节等影响的结果[11]。本研究采用随机双盲实验验证胶原蛋白肽对头发质量的改善作用，并通过体外细胞培养初步探讨了胶原蛋白肽对表皮细胞细胞的增殖作用。

本研究结果显示，试验组服用后头发直径大于安慰剂组（P＜0.05）；试验组服用后头发脱落根数少于少于安慰剂组（P＜0.05），表明服用盛美诺CP-01胶原蛋白肽与安慰剂相比，能够增加头发的直径，减少头发脱落根数。HaCaT细胞是人类永生表皮细胞系，也称为表皮角质形成细胞，是非种类来源的正常人皮肤永生角质形成的细胞株，与正常人角质形成细胞分化相似，被广泛用来研究角质细胞。角质细胞属于上皮细胞系。在脱发及生发研究中HaCaT细胞用来代替毛囊角质细胞、毛囊上皮细胞，通过体外试验研究受试物对毛囊上角质细胞、毛囊上皮细胞的影响[12]。体外培养的HaCaT细胞分泌的EGF能促进角阮细胞的迁移和增殖，促进毛囊和汗腺细胞的增殖，正常水平的EGF能刺激表皮基底层和外毛根鞘的生理性生长。EGF在皮肤中广泛表达，其对毛囊发育和生长调节有重要作用。EGF具有调控毛囊分化和细胞特异性的功能，毛发生长的启动需要EGF受体的激活[13]。此外，EGF还能促进毛囊外根鞘细胞的生长和迁移，诱导细胞群分化成外根鞘表型[14，15]。另有研究表明[16]，胶原蛋白肽能够改善血液微循环，改善皮肤（头皮）及其附属器营养。够在本研究中，胶原蛋白肽能够促进HaCaT细胞增殖，且EGF合成增强，CP-01相较于其他同样来源的胶原蛋白肽效果更明显。

综上所述，胶原蛋白肽能够使头发变粗，减少头发脱落。这可能与胶原蛋白肽促进表皮细胞增殖增强EGF合成有关。