循环肿瘤细胞的鉴定分析方法研究现状及进展

马 莹 综述，宁大为，于华杰，王振丹，李 胜，夏 梅，李 浩△ 审较

1.山东省药物研究院，山东济南 250062；2.山东第一医科大学附属肿瘤医院/山东省肿瘤防治研究院/山东省肿瘤医院肝胆外科，山东济南 250117；3.山东第一医科大学/山东省医学科学院，山东济南 250117；4.山东省济南市章丘区人民医院急诊外科，山东济南 250200

恶性肿瘤的复发及转移是世界范围内恶性肿瘤患者病死率升高的重要原因[1-2]。近期研究表明，循环肿瘤细胞(CTC)可能是恶性肿瘤侵袭、转移的重要原因之一[3]，因CTC具有稀有性、异质性等特点，对鉴定分析造成困难。针对以上问题，本文对CTC的鉴定分析方法及应用现状及进展进行综述。

1 CTC的生物学特性

CTC是指自发或因诊疗操作从原发或转移肿瘤中脱落进入外周血液循环的一类肿瘤细胞[3]。1869年ASWORTH[4]在转移性恶性肿瘤患者的外周静脉血涂片中发现了大小、外观与肿瘤细胞完全相同的细胞，首次提出了CTC的概念。研究发现，在转移性恶性肿瘤患者中，进入血液的大部分CTC短期内被吞噬或发生凋亡，存活的CTC在血液中经过一段时间的潜伏，侵入组织中形成可检测到的病变[5-8]。极少数具有高活性和转移性的CTC相互聚集，形成循环肿瘤微栓子(CTM)，从而具有更强的侵袭和抗吞噬能力[9]。CTC的稀有性和其本身的异质性，对CTC的检测提出了挑战性。

2 CTC的检测方法

由于外周血中CTC水平较低，其检测过程可分为对外周静脉血中CTC的分离富集和鉴定分析。富集是利用肿瘤细胞的生物、物理特性分离CTC与血细胞，以提高其检测灵敏度，其中无需特殊标志物的富集方法包括膜滤过分离肿瘤细胞技术(ISET)、密度梯度离心技术和介电泳技术等[10]。依据生物亲和原理的富集方法，还包括基于细胞表面肿瘤标志物上皮细胞黏附分子(EpCAM)和细胞角蛋白(CK)表达的免疫磁性阳性筛选法和阴性筛选法等[11]。但是因富集方法不同，富集后的CTC中常混杂着白细胞、单核细胞，甚至循环内皮细胞，需要进一步鉴别区分。CTC的鉴定分析是利用肿瘤细胞的形态学特征或表面抗原、遗传物质等对CTC进行区分和研究。

3 基于细胞病理学原理鉴定分析CTC

CTC从肿瘤原发灶或转移灶脱落进入循环系统，与原发肿瘤细胞在形态学上相似，与正常血细胞在形态学上有所差异。通过细胞化学染色方法，依据细胞病理学原理，由光镜下的细胞形态学判定异常细胞。光镜下判别的参考项目主要包括细胞或细胞核直径、核质比、细胞核性状与染色情况等[12-13]。VONA等[14]利用ISET对外周血中掺入的肿瘤细胞株(HepG2、Hep3B、MCF-7、HeLa和LNCaP)进行分离鉴别，在滤膜上观察到了与所用肿瘤细胞株相似的细胞。LU等[15]使用8 μm孔径滤膜对61例食管鳞状细胞癌患者及22例健康志愿者的外周血进行富集，依据细胞病理学标准对采集到的细胞进行分析发现，食管鳞状细胞癌患者CTC检出率为32.8%(20/61)，而健康志愿者外周血中未发现CTC。

但HOFMAN等[16]利用ISET研究了良性肿瘤患者、恶性肿瘤患者和健康志愿者外周血中的CTC，依据细胞病理学标准判别分离得到细胞的良恶性，发现具有恶性特征的细胞在良性肿瘤患者和恶性肿瘤患者中分别占5.3%和43.1%。而NANOU等[17]通过扫描电镜发现前列腺癌细胞株在使用孔径为5 μm的滤膜过滤时，由于压力、滤孔数目和分布密度等原因可能受到损伤，导致相应的细胞表面特征丢失，甚至核的形状发生改变，诊断出的假阳性结果使细胞病理学标准在CTC检测中的应用仍需进一步研究。

4 基于分子特征鉴定分析CTC

4.1基于遗传物质鉴定分析CTC

4.1.1通过基因表达及突变鉴定分析CTC 荧光原位杂交 (FISH)能够定位染色体上特殊DNA序列，或探测、定位RNA，可在基因组水平上检测CTC中单个基因的变化[10]。ZHAO等[18]通过FISH技术将CTC分为3个亚组：上皮标志物(CK、EpCAM)阳性，CD45-细胞(上皮性CTC)；上皮表型/间充质标记阳性，CD45-细胞(混合表型CTC)；间充质标志物(Twist、Vimentin)阳性，CD45-细胞(间质性CTC)。有学者对具有特殊分子改变的肿瘤患者进行了研究，PAILLER等[19]采用FISH技术检测了39例以克唑替尼作为间变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂治疗ALK重排非小细胞肺癌(NSCLC)患者，发现ALK拷贝数增加的CTC，CTC数量的变化可能是克唑替尼在ALK重排NSCLC患者疗效的预测性生物标志物。

反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)可检测血液标本中是否存在CTC，用于PCR检测的核酸片段主要来自于上皮或特异性表达组织，因此能够降低白细胞对检测结果的影响[20]。尽管RT-PCR检测灵敏度高，但由于异常转录和假阳性，特异度可能较低，这限制了RT-PCR用于CTC的鉴定。

4.1.2通过染色体畸变鉴定分析CTC 人类染色体异常包括染色体数目畸变、结构异常，几乎所有肿瘤患者都出现染色体异常[21]。研究人员试图通过鉴别染色体异常细胞从而区分CTC与其他细胞。XU等[22]分析发现胰腺癌患者外周血中，三倍体(8号染色体)CTCs≥3组的1年生存率和总生存率比三倍体CTCs<3组短，三倍体CTC计数而不是总CTC计数可以作为化疗敏感性的预测因子。研究还发现恶性肿瘤患者血液中分离的CTC中多个染色体可能以多倍体形式存在，SWENNENHUIS等[23]用FISH探针标记了前列腺癌的1号、7号、8号和17号染色体着丝粒区域，发现以上染色体均存在多倍体现象。KIM等[24]通过基于细胞大小的过滤平台，采用FISH技术检测外周血标本中细胞染色体的异常拷贝数，在肺癌患者和良性肺病患者外周血中均检测到非整倍体细胞，这些发现揭示了在使用FISH进行恶性肿瘤诊断时出现假阳性的可能性。

4.1.3通过测序技术鉴定分析CTC 测序技术通过碱基序列信息获取特定基因组或该基因组中的目标区域的碱基，是分析恶性肿瘤特定基因组畸变的有力工具[25]。与其他技术相比，可以发现导致显著的表型改变的微小遗传突变，实现分析自动化，降低人工偏倚[26]。CAPPELLETTI等[27]通过下一代测序技术，发现在转移性肾癌患者外周血中CTC存在异质性，部分CTC含有9p21.3缺失，证明CTC的分子特征能够预测可能与肿瘤进展相关的亚克隆事件。LEE等[28]通过下一代测序技术，对妇科肿瘤患者无细胞循环DNA(cfDNA)和循环肿瘤DNA(ctDNA)的变异进行比较，认为联合检测肿瘤患者cfDNA和CTC可提高液体活检诊断恶性肿瘤的灵敏度，这有望为指导恶性肿瘤的临床治疗策略提供更好的遗传靶点信息。测序技术也有几个明显的缺点，例如测序成本、通量、深度、灵敏度及标本要求等方面的局限，使单细胞分析具有一定难度。

4.1.4通过微阵列技术鉴定分析CTC 基因表达谱和微阵列比较基因组杂交(aCGH)技术已被用来检测CTC表达情况，基因表达谱能在RNA水平上提供有关标本的信息，特别是可疑和新转录物的上/下调节，而aCGH能在DNA水平上提供有关标本的信息，包括拷贝数变化、特定突变变体或全局基因组变化[29]。STEINERT等[30]通过aCGH、突变谱和微卫星检测技术(MSI)，证实了结直肠癌来源的单个CTC的肿瘤细胞特性，CTC的突变谱与相应的肿瘤组织相似，但不完全相同，一些CTC在关键基因如KRAS或TP53上出现了在原发肿瘤灶中无法检测到的突变。

4.2基于免疫学方法鉴定分析CTC 该类方法通过细胞表面抗原的表达情况，利用免疫组化或免疫荧光技术，研究不同标志物在细胞表面的表达情况，如鉴别CTC和白细胞，对富集的CTC进行定量、定性分析。强生开发的CellSearch系统采用的检测方法曾经是公认比较可靠的方法，利用CK8/18/19、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、CD45标志物组合对富集标本进行检测，将CK8/18/19阳性、DAPI阳性、CD45阴性的细胞定义为上皮类型CTC[31]。LI等[32]通过对富集CTC进行E-Cadherin、Vimentin和Twist的三联免疫荧光染色，46例CTC阳性患者中有32例(69.6%)共表达Twist和Vimentin，与门静脉癌栓、TNM分级及肿瘤大小密切相关。部分研究人员引入了肿瘤相关抗原来鉴定分析富集到的细胞。BERGMANN等[33]使用CellSearch系统对49例晚期溃疡性结肠炎(UC)的血液标本进行分析，发现16例CTC阳性患者中有10例(63%)表达PD-L1，患者体内和不同患者间CTC的PD-L1表达具有异质性，PD-L1表达的CTC与较差整体生存率相关。目前没有特异性的标志物可彻底区分CTC与其他细胞，不同类别的组织表达的标志物可能不同，甚至相同类别的组织也可表达异质的标志物，肿瘤标志物在某些情况下的表达会升高[34]。因此，通过免疫学方法检测特定标记物得到的结果不一定是CTC。

5 细胞病理学结合免疫学方法鉴定分析CTC

外周血中可能存在着数量稀少的单核细胞、巨核细胞及因炎症等因素进入血液的内皮细胞，甚至正常的上皮细胞，这些细胞有时很难通过细胞病理学标准进行判断。例如有研究者在乳腺癌和黑色素瘤患者中发现一些非常大的非典型细胞(>30 μm)具有多叶核，但血小板标记CD61的ICC染色证实了它们是巨核细胞[35]。因此，研究者在细胞化学染色与细胞病理学识别的基础上，联合了免疫组织化学法或免疫荧光法对结果进行验证[36-37]。常用的方法是对难以通过形态特征判别的异常细胞，通过上皮细胞相关抗原(EpCAM、CK等)和白细胞特异性抗原CD45进行验证。TSUTSUYAMA等[38]利用巴氏染色(Pap)法结合免疫细胞化学(ICC)法对CTC进行细胞学诊断，将CTC定义为CK阳性且具有恶性形态学特征的非典型细胞，单独或结合Pap染色进行CD34(内皮细胞)、CD61(巨核细胞)、CD68(巨噬细胞)及CD45(白细胞)的ICC以供确认。随着科技手段的进步，未来或许能够将细胞病理学鉴定方法与遗传学鉴定方法联合应用，进一步明确鉴定CTC结果。

6 其他检测鉴定CTC的方法

恶性肿瘤在转移过程中，除使恶性肿瘤细胞进入血液参与循环系统外，会有部分恶性肿瘤细胞进入体液(尿液、胸腔积液等)，通过对该部分进行检测，可以为肿瘤的转移提供辅助诊断。尿液标本CTC检测未见相关报告，有研究选取10例肺癌患者胸腔积液标本，利用糖酵解及单细胞测序技术检测到存在恶性肿瘤细胞，建立了胸腔积液检测CTC技术体系[39]。另有研究者选取50例肺腺癌患者，采集外周血、胸腔积液及脑脊液进行检测，探究糖代谢用于CTC检测的可行性，发现己糖激酶-2(HK2)是检测CTC的代谢功能相关标记物，用于NSCLC可能在治疗前确定患者的预后[40]。

7 展 望

美国癌症联合委员会(AJCC)在《AJCC肿瘤分期手册(第7.8版)》中强调了CTC作为肿瘤cM0(i+)的重要意义，证明CTC的鉴定分析可为乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、肝癌等实体肿瘤的疗效评价和预后评估提供实时监测信息。但是目前大多数的鉴定方法区分的是具有某些分子特征特定细胞群，严格意义上并不能称为CTC。组织病理学是肿瘤诊断的金标准，细胞化学染色联合免疫学方法通过细胞病理学形态标准初步识别富集细胞的良恶性，进一步结合细胞表面抗原区分CTC、脱落上皮细胞和血液细胞，能够最大程度降低检测结果的假阳性和假阴性。对CTC形态学鉴定的标准化及深入研究，以及对CTC的形式分析有助于揭示CTC与循环中血细胞、免疫细胞的相互作用，阐明CTC免疫逃逸和转移播散的机制，有利于推动CTC鉴定领域的极大发展。