鼻咽癌患者癌组织中HDAC1、HDAC7表达与临床、病理特征及预后的关系

王淑云，卢雅艳，李 佳

中国人民解放军火箭军特色医学中心耳鼻喉科，北京 100161

鼻咽癌是源于咽部上部区域的恶性肿瘤，全球每年约有10万例鼻咽癌确诊病例，其中大部分病例发生在我国，以及南亚、北非和北极地区[1-2]。鼻咽癌发病是多因素作用的结果，包括EB病毒感染、遗传易感性、不健康的生活方式和环境危害(如吸烟和接触灰尘污染)等[3-4]。尽管近年来对鼻咽癌的治疗取得了较大进步，然而大多数鼻咽癌患者因症状无特异性，往往被诊断时已至中晚期，已出现肿瘤侵袭、远处转移，导致患者预后不佳[5]。因此，探索能够诊治鼻咽癌的有效生物标志物对提高患者早期诊断率、改善患者预后意义重大。组蛋白去乙酰化酶(HDAC)是一类细胞内的金属蛋白酶，具有调控细胞生长和凋亡的作用，可影响相关基因的转录和表达[6]。在雌激素受体(ER)阳性乳腺癌细胞系中沉默HDAC1会抑制细胞生长和细胞周期进程并诱导细胞死亡[7]。HDAC1在卵巢癌患者的血清中明显升高，建议将HDAC1作为诊断卵巢癌的血清生物标志物[8]。HDAC7在生理和病理条件下调节细胞增殖、分化、凋亡、迁移等[9]。目前，在肺癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、神经胶质瘤和淋巴瘤中观察到HDAC1、HDAC7的异常表达[10]。然而，目前鲜有关于HDAC1、HDAC7在鼻咽癌患者中表达的研究报道。因此，本研究拟探讨鼻咽癌患者癌组织中HDAC1、HDAC7表达水平及其与临床、病理特征和预后的关系，以期为鼻咽癌的诊治提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年1月至2018年1月本院收治的鼻咽癌患者102例为研究对象，其中男50例，女52例；年龄38～72岁。纳入标准：(1)病理检查确诊为鼻咽癌；(2)所有鼻咽癌患者在最初活检时未接受过放疗或化疗；(3)临床及随访资料完整。排除标准：(1)临床信息不完整；(2)随访失败或死亡原因不明；(3)合并其他肿瘤；(4)合并严重心血管疾病；(5)妊娠期女性。对102例鼻咽癌患者均连续随访至2021年1月。根据世界卫生组织(WHO)的鼻咽癌组织学分类标准，所有患者都具有明确的鼻咽癌组织学诊断依据。根据国际抗癌联盟(UICC)和美国癌症联合会(AJCC)第8版鼻咽癌TNM分期系统(2017)的标准对鼻咽癌患者进行分期。患者及家属了解本研究，并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1标本采集 采集所有研究对象癌组织及癌旁组织，分别纳入鼻咽癌组与癌旁组。

1.2.2免疫组织化学法检测HDAC1、HDAC7表达 通过免疫组织化学法检测鼻咽癌患者癌组织及癌旁组织中HDAC1、HDAC7的表达水平。石蜡切片脱蜡(10 min)，乙醇脱水(浓度顺序依次为100%、95%和75%)，并用聚丁二酸丁二醇酯洗涤(3 min)。将组织与3%H2O2一起孵育(20 min，室温)以阻断内源性过氧化物酶活性，蒸馏水洗涤(5 min)。将切片置于0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲溶液(pH值为6)中进行抗原修复，95～100 ℃下加热10 min，然后用聚丁二酸丁二醇酯洗涤(5 min)。将切片在室温下转移到抗原中修复10 min，采用聚丁二酸丁二醇酯(3 min)洗涤。在室温下与10%牛血清清蛋白孵育(20～30 min)后，将组织与50 μL小鼠抗人HDAC1、HDAC7抗体(1∶5 000、1∶2 000，Boster，中国，批号：652414、741659)在4 ℃下孵育过夜。用聚丁二酸丁二醇酯作为阴性对照，然后在37 ℃下复温30 min，用聚丁二酸丁二醇酯洗涤(3 min)。每张切片用50 μL生物素偶联的二抗在37 ℃下孵育30 min，然后用聚丁二酸丁二醇酯洗涤(3 min)。将链霉亲和素-过氧化物酶加入切片，在37 ℃下孵育30 min，并用聚丁二酸丁二醇酯洗涤(4 min)。组织在室温下用二氨基联苯胺溶液染色，然后在控制染色时间的显微镜下观察。随后，用蒸馏水终止相应的反应。苏木精用于复染，然后用蒸馏水洗涤切片。用稀盐酸清洗染色切片表面，用自来水冲洗3 min。脱水后依次进行二甲苯透明和中性胶封片，显微镜下观察切片。

免疫组织化学法检测结果由两名经验丰富的病理学医师采用双盲法确认。HDAC1、HDAC7的表达产物定位在细胞质中，鼻咽癌组织细胞HDAC1、HDAC7免疫组织化学法染色后细胞质中出现褐色颗粒为阳性。每张切片随机选取10个高倍视野(×400)，每个视野计数100个细胞。从染色强度与阳性细胞百分比两个方面判定染色指数(SI)。染色强度：无明显染色计0分，有淡黄色染色计1分，有棕黄色染色计2分，有棕褐色染色计3分；阳性细胞百分比：无阳性细胞计0分，阳性细胞占比<34%计1分，34%～<68%计2分，≥68%计3分。SI：SI=染色强度得分×阳性细胞百分比得分，SI≥5分为阳性表达，SI<5分为阴性表达。

1.2.3随访 术后每3个月通过电话和问卷调查信对患者进行随访。从最初的手术日期到死亡日期为总生存期。通过家庭报告确定患者的死亡，并通过查阅公共记录进行核实。所有患者出院后均随访3年或直至患者死亡。

1.3统计学处理 采用SPSS25.0统计软件进行数据处理及统计分析，HDAC1、HDAC7在组织中的表达采用例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验；采用多因素Cox回归模型探讨影响鼻咽癌预后的相关因素。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1癌旁组、鼻咽癌组中HDAC1、HDAC7表达情况比较 鼻咽癌组HDAC1、HDAC7阳性率高于癌旁组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2不同特征鼻咽癌患者的 HDAC1、HDAC7表达情况比较 不同性别、年龄鼻咽癌患者HDAC1、HDAC7阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；肿瘤最大径≥2 cm、TNM分期为Ⅲ/Ⅳ期、浸润深度为深肌层、分化程度为低分化、有淋巴结转移、有复发的鼻咽癌患者HDAC1、HDAC7阳性率明显高于肿瘤最大径<2 cm、TNM分期为Ⅰ/Ⅱ期、浸润深度为黏膜层及肌层、分化程度为高分化、无淋巴结转移、无复发的鼻咽癌患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3鼻咽癌患者预后情况 102例鼻咽癌患者出院至随访结束，3年生存率为60.8%(62/102)。HDAC1阳性和阴性患者3年总生存率分别为45.7%(32/70)和93.8%(30/32)，而HDAC7阳性和阴性患者3年总生存率分别为51.4%(38/74)和85.7%(24/28)；HDAC1、HDAC7阳性的鼻咽癌患者3年生存率均明显低于HDAC1、HDAC7阴性的鼻咽癌患者，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 癌旁组、鼻咽癌组中HDAC1、HDAC7表达情况比较[n(%),n=102]

表2 HDAC1、HDAC7表达与鼻咽癌临床、病理特征的关系[n(%)]

2.4影响鼻咽癌患者预后的单因素分析 肿瘤最大径≥2 cm、TNM分期为Ⅲ/Ⅳ期、浸润深度为深肌层、分化程度为低分化、有淋巴结转移、有复发的鼻咽癌患者3年生存率明显低于肿瘤最大径<2 cm、TNM分期为Ⅰ/Ⅱ期、浸润深度为黏膜层及肌层、分化程度为高分化、无淋巴结转移、无复发的鼻咽癌患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.5影响鼻咽癌患者预后的多因素Cox回归分析 TNM分期Ⅲ/Ⅳ期、分化程度低、HDAC1阳性、HDAC7阳性是鼻咽癌患者预后不良的独立危险因素(P<0.05)。见表4。

表3 影响鼻咽癌患者预后的单因素分析[n(%)]

表4 影响鼻咽癌患者预后的多因素Cox回归分析

3 讨 论

鼻咽癌是我国华南地区耳鼻咽喉科最常见的恶性肿瘤，转移和复发是其治疗失败的主要因素。早期预测鼻咽癌预后需要一种特异度及灵敏度高，且成本效益高的新型血清蛋白生物标志物，以减少鼻咽癌治疗失败。由BRLF1编码的Rta蛋白(一种转录激活因子)是EB病毒早期裂解的产物，是调节EB病毒感染从潜伏期到裂解阶段变化的关键因素，因此被提出作为诊断鼻咽癌的分子生物标志物。此外，微小RNA(miR)-10b和miR-34也是用于鼻咽癌诊断和预后评估的潜在新型核酸标志物。然而，这些标志物不能用于预测鼻咽癌转移和复发。

HDAC1、HDAC7在许多生理、病理过程中发挥着重要作用，包括细胞分化、基因表达、免疫系统调节、细胞衰老、程序性细胞死亡和致癌过程。GUO等[11]的研究证实HDAC1、HDAC7参与致癌、血管生成、细胞增殖和侵袭过程，与肿瘤的发生和发展有关。另外，ISHIKAWA等[12]也证实肿瘤的许多生理、病理过程与HDAC1、HDAC7相关，如肿瘤的免疫调节、细胞凋亡、耐药性等，并且HDAC1、HDAC7还参与癌基因激活和抑癌基因失活。另有研究已在各种肿瘤中检测到HDAC1、HDAC7的异常表达，包括结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌和食管癌[13]。既往研究表明，HDAC1、HDAC7的表达升高可抑制细胞凋亡，与星形细胞瘤患者预后不良关系密切[14]。HDAC1、HDAC7阳性表达与ER/孕激素受体表达呈负相关，可预测浸润性导管乳腺癌的不良预后[15]。本研究结果显示，鼻咽癌组HDAC1、HDAC7阳性率高于癌旁组，差异有统计学意义(P<0.05)。肿瘤最大径≥2 cm、TNM分期为Ⅲ/Ⅳ期、浸润深度为深肌层、分化程度为低分化、有淋巴结转移、有复发的鼻咽癌患者HDAC1、HDAC7阳性率明显高于肿瘤最大径<2 cm、TNM分期为Ⅰ/Ⅱ期、浸润深度为黏膜层及肌层、分化程度为高分化、无淋巴结转移、无复发的鼻咽癌患者，差异有统计学意义(P<0.05)。说明HDAC1、HDAC7与鼻咽癌临床、病理特征有关。

HDAC1、HDAC7是反映癌症发生和某些癌症侵袭性的生物标志物。据报道，与正常大肠黏膜组织相比，大肠腺癌组织中HDAC1、HDAC7过度表达，HDAC1、HDAC7在上皮和固有层中均被发现，HDAC1、HDAC7也被证实与大肠癌的淋巴结转移相关[16]。在机制方面，HDAC1、HDAC7可以增加抗凋亡Bcl-xl和Bcl-2的表达丰度，并降低促凋亡Bax蛋白水平[17]。HDAC1、HDAC7还被证明在多种恶性肿瘤中高表达，可能作为预后不良的标志物，靶向降低HDAC1、HDAC7表达水平可能是肿瘤的一种治疗方法[18-19]。本研究发现，HDAC1、HDAC7阳性的鼻咽癌患者3年生存率均明显降低(P<0.05)。且鼻咽癌患者预后的单因素分析发现，肿瘤最大径≥2 cm、TNM分期为Ⅲ/Ⅳ期、浸润深度为深肌层、分化程度为低分化、有淋巴结转移、有复发的鼻咽癌患者3年生存率明显低于肿瘤最大径<2 cm、TNM分期为Ⅰ/Ⅱ期、浸润深度为黏膜层及肌层、分化程度为高分化、无淋巴结转移、无复发的鼻咽癌患者，差异有统计学意义(P<0.05)。HDAC1、HDAC7阳性是鼻咽癌患者预后不良的独立危险因素(P<0.05)。临床研究表明，HDAC1、HDAC7结合癌胚抗原和糖类抗原19-9可用于结直肠癌早期诊断[20]，本研究未探讨HDAC1、HDAC7对鼻咽癌的诊断效能，这将在后续研究中进行。

综上所述，鼻咽癌患者癌组织中HDAC1、HDAC7高表达，其与临床、病理特征有关，HDAC1、HDAC7阳性是鼻咽癌患者预后不良的独立危险因素。