精子tsRNA 参与跨代遗传的研究进展

刘政麟 裴仕隆 韩 宇 陈周昊 审校 刘 悦 丁之德

1.上海交通大学医学院2019 级临床医学八年制；2.上海交通大学医学院 组织胚胎学与遗传发育学系

tsRNA（tRNA-derived small RNAs）是近几年受到高度关注的具有基因调节功能的一类非编码小RNA，其来源于tRNA，且属于tRNA 在生理或病理条件下切割后产生的新的小RNA。 早期有关tsRNAs 结构和功能的研究认为，tsRNAs 作为一种RNA 损伤后的降解产物，只是随机的核苷酸序列，本身没有与生理代谢过程相关的结构或功能特性； 同时， 由于这些small non-cpdomg RNA 片段数量太少，推测其对早期胚胎发育并不发挥重要作用。 然而， 近年来的研究表明，tsRNAs 并不是无意义的随机片段， 而是由特定的酶识别特定的位点， 从而产生的具有特定结构和功能的非编码小RNAs。 随着研究的深入，tsRNAs 在细胞活动中的重要性逐渐被发现。 tsRNAs 对多种生理代谢过程具有调控功能，如在细胞增殖和凋亡、蛋白质翻译调控、核糖体生物合成、免疫反应、精子RNA 介导的表观遗传等多种生理过程中发挥着关键作用。 本文主要综述了tsRNA 的产生、修饰、参与精子介导的跨代遗传等研究进展。

一、tsRNA 的来源与分类

（一）tsRNA 的来源

20 世纪70 年代末，tsRNA 被认为是tRNA 随机降解的产物，并未引起足够的重视。 随着高通量测序技术的广泛应用，人们在细菌、真菌、植物和哺乳动物中进一步研究并分析了tsRNA 的产生环境。 在tsRNA 产生过程中， 存在着多种复杂的处理程序，tRNAs 首先被RNA 聚合酶III 转录成前体tRNA 副本，随后在RNase P和RNaze Z 的加工后产生tsRNA， 根据核酸内切酶切割的位置不同可以对tsRNA 进行分类， 此过程的副产物也可以作为单独的tsRNA 参与细胞的生理活动[1-4]。

（二）tsRNA 分类

根据酶切割位点不同，tsRNA 大致可分为五类：

1.5’tsRNA，这是含量最丰富的一类tsRNA，来源于成熟tRNA 的5’端。 在正常条件下，由Dicer 或其他核酸内切酶切割tRNA D 环与反密码子环之间的茎可产生5’tsRNA，而在低氧、高辐射、蛋白质缺乏、细菌病毒感染等应激状态下，由angiogenin、RNY,Ro60-Associated Y1、RNase L 等切割tRNA 反密码子环也可产生5’tsRNA。 5’tsRNA 通常包含tRNA 的第一个核苷酸，通常终止于tRNA 的反密码子环。 不同来源的5’tsRNA 大小不同， 如human embryonic kidney cells 293 细胞、前列腺癌细胞和Halophage Archaea 的5’tsRNA 大小差异显著。 5’tsRNA 大小一般在30-35 nt（核苷酸）之间，但也存在一些规模较小的部分，这些较小的5’tsRNA 进一步分为3 个亚组，18-20 nt 片段，25 nt 片段和27-30 nt 片段。 这些小RNA 的5’端和tRNA 的5’端高度相似，这表明3’端核酸内切酶的剪切位置决定了这些片段的大小[5-7]。

2.3’tsRNA。 3’tsRNA 来源于成熟的3’末端，其中常含有标志性的CCA 序列。 在正常与应激状态下，TΨC 环以及反密码子环和TΨC 环之间的茎可被Dicer 或其他核酸内切酶切割产生3’tsRNA, 可根据它们的大小分为3’tsRNA 或3’halves(35-45 nt)和较小的

tRF-3s(18-20 nt)[5-7]。

3.tRNA 前体的3’拖车序列。 RNase P 和RNase Z分别在成熟过程中处理细胞核中5’ 端前导序列和3’端尾部序列的前tRNA， 生成的30 个拖尾序列变成14-48 nt 长的tsRNA。 它们的5’末端在tRNA 基因组序列的3’末端之后开始，而它们的3’末端是由多尿苷尾部形成，即RNA pol III 终止信号。 虽然该类tsRNA 通常被认为是在细胞核中产生， 但亦有报道显示， 这类tsRNA 中的tRNA-related fragment-1001 是由ElaC Ribonuclease Z 2 产生，ELAC2 是一种由前列腺癌易感基因编码的tRNA 3’内切酶[8]。这一发现提示该类3’拖车序列(Trailer Sequence)可能起源于多条生物发生途径。

4.第四类是tRNA 半体，这是一类在tRNA 的反密码子环处切割产生，且大小为30-40 nt 的tsRNA，因它们几乎是其前体tRNA 长度的一半，故称为tRNA 半体（也被称为tRNA halves）。tiRNA 可简单分为两类(即5’tiRNA 和3’tiRNA)。 5’tiRNA 的5’ 末端对应于前体tRNA 的5’末端，而3’末端位于前体tRNAs 的反密码子环内。因此，3’tiRNA 的3’端与前体tRNA 的3’端的CCA 序列相匹配， 它们的5’ 端是反密码子环的一部分。 参与tiRNA 生成的主要酶是血管生成素， 它是RNase A 超家族的成员。 在正常情况下，血管生成素定位于细胞核内，或与血管生成素抑制剂ribonuclease inhibitor 1 一起以非活性形式存在。 然而，在应激条件下，血管生成素从细胞核释放或从RNH1 解离， 并在其反密码子环处切割tRNA 以生成tiRNAs，但也有报道称，在亚砷酸盐处理的条件下， 加工tRF5-AlaCGC(tRNA半体)需要血管生成素和Disher 共同作用。

5.其他tsRNA，其来源于tRNA 或tRNA 前体其他区域的切割。 这些其他类型的tsRNA，也称为I-TRF 或TRF-2， 包括其前体tRNA， 且含有反密码子的内部区域；它们的长度可变。最后，还有一组tsRNA，其5’端对应于前tRNA 的前导序列5’端，而其3’端对应于反密码子环的5’端外显子。 目前这两种类型的tsRNA 产生的详细原理还未见[9]。

由上述可见，tsRNA 可通过核酸内切酶在tRNA 特定位点上的裂解生成，这些小RNA 不是简单的降解产物， 并且不同类型的tsRNA 具有不同的生物学发生机制，并且也可能有不同的生物学作用。

二、tsRNA 研究技术

目前对tsRNA 的研究主要集中在其对某些疾病或生理现象的影响过程，通常包括tsRNA 的分离纯化、定量测量、特异性地增加或减少。 如首先对不同状态的组织进行tsRNA 的分离和纯化， 以获取特定的研究对象中所富集的tsRNA， 然后通过生物化学技术分析不同的tsRNA 成分， 筛选可能会对生理功能产生重要影响的tsRNA 种类。最后并对此进行验证，并通过特异性地提高或降低tsRNA 的含量， 观察细胞或组织所发生的变化而得出结论。 在这期间，为了得到高效且准确的研究结果，现主要的应用方法包括micro array，RNA-seq，Northern blotting，Cross-linking ligation and sequencing of hybrids(CLASH)等。

（一）Micro array 是一种高通量检测tsRNA 表达的有效方法，其主要是通过制作特定基因芯片对目标tsRNA 进行含量方面的分析。其特点是拥有极高的特异性以及灵敏度。 Schena 等利用不同种属的cDNA 与荧光探针杂交， 在鼠与酵母对照组中未发现拟南芥基因表达阳性情况[10]，以此来验证该技术。 同时De Saizieu 等人证明其灵敏度强于Northern 杂交， 错误的重复率低于25%[11]， 但其在针对sncRNAs 测量方面存在对小RNA 覆盖面不全这一不可忽视的问题。 Balatti V 等人通过将肿瘤样本中总RNA 与特定的RNA 样品进行杂交后确定了tsRNA 的表达与肿瘤中原癌基因表达的关系，进而发明了一种基于tsRNA 的诊断技术[12]。Farina NH等人在验证四种tsRNA （ts-19，ts-29，ts-46 和ts-112）可能与抑癌基因RUNX Family Transcription Factor 1 的抑制性表达相关过程中也使用了类似的杂交原理[13]。

（二）RNA-sequencing 技术是micro array 技术的迭代产品，其将目标RNA 纯化后反转录为cDNA 并进行测序。 技术的主要难点在于sncRNA 片段的选取以及基因组数据的完整性。 前者需要考虑tsRNA 片段大小范围及该范围内目标RNA 纯度。 tRFs 首先在17-26nt小RNA 序列区段被发现[12]，但该非编码RNA 大部分长度大于30nt。 至于后者，因无法确定其他未探明区段是否存在tsRNA，很可能造成假阴性结果，即产生大量未与已知基因组匹配的序列，其含量可能高达70%[13]。

（三）Northern blotting 是检测tRF 和tiRNA 的一种重要方法。 将RNA 电泳分离后与相应被标记的探针杂交，通过信号反应显示其含量。 该技术费用较低，操作简便，但存在纯度较低，易出现未知RNA 链污染的情况。 Kim HK 等人[4]在大鼠原位肝细胞癌模型中研究LeuCAG3′tsRNA 诱导快速分裂细胞凋亡的作用时采用了这一方法， 并最终验证得到了一条较为清晰的分子作用机制通路。 由于tsRNA 在分子间相互作用关系中所处的独特位置，可能会建立另一种转录后机制，同时，利用这一机制，可以在不同的生理状态下微调基因表达，即为治疗癌症新的潜在性靶点。

需要指出的是， 在RNA 提取与含量分析实验中，通常是多种检测方式共同使用。Northern blot 常用于初期目标RNA 提取鉴定与目标tsRNA 片段长短定位，micro array 与RNA-seq 则主要应用于特异大小tsRNA表达情况的精准测量。

三、tsRNA 修饰调节

tsRNA 是经特定的酶在tRNA 特定的位置进行切割后产生，因此tsRNA 可以携带tRNA 的多种RNA 修饰。 这些RNA 修饰一方面可以增强或者抑制核酸内切酶的活性， 改变核酸内切酶切割tRNA 的效率[14]。Donovan J 等在人类细胞中证明了tRNA 反密码子环第34 位G 到Q 的修饰可以介导RNaseL 对tsRNAHis第36 位的特异性切割[15]。 在其他物种细胞如大肠杆菌tRNATyr/Asn/His/Asp 反密码子环摆动位置的queuosine(Q34)修饰能增加RNA 酶Colicin E5 的活性；在乳酸克鲁维酵母中发现tRNAGlu（UUC）、tRNALys（UUU）和tRNAGln（UUG）第34 位的mcm2s2U 修饰对酵素在反密码子环摆动位置的切割非常重要。另一方面，RNA 修饰也可以调节应激诱导的tsRNA 切割。 DNA（cytosine-5）-methyltransferase-like protein 2 和NOP2/Sun RNA Methyltransferase 2 介导的m5C 修饰， 能增加tRNA 的稳定性；Blanco S 等人证明了m5C 的缺失增加血管生成素介导的细胞内核酸内切酶对tRNA 的剪切能力，使得tRNA容易在反密码处被切割而产生更多的tsRNA[16]。

tsRNA 在经过修饰后形成的特殊结构会存储遗传信息。 Safra M 等发现m1A 修饰缺失会导致tsRNA 内部不能正常形成碱基配对的结论基础上， 进一步研究发现tsRNA 不能正常折叠成倒L 型结构， 而产生意外的二级结构，导致其无法正常发挥作用[17]。 这些特异位点的改变可能会引起tsRNA 对RNA 酶消化的抵抗性，并改变其生物学功能。

四、精子tsRNA 参与父系跨代遗传

相较于含有大量RNAs 的卵母细胞， 由于精子中sncRNAs 数量太少， 早期不认为其在子代遗传发育中产生重要作用。 近年来，该观点已被修正即精子sncRNAs 在子代遗传发育中的作用得到了初步的实验论证。

Chen 等人[18]通过实验证明父代受环境影响产生的获得性性状可以通过tsRNA 传递给子代。在实验中，通过向5 周龄F0 雄性小鼠喂食高脂肪饮食（high-fat diet,60%脂肪） 构建父代饮食导致代谢紊乱的代际传递模型，同时向其他同期F0 雄性小鼠喂食正常饮食(normal diet,10%脂肪)构建对照组。 喂食六个月后，高脂肪饮食组小鼠展现出肥胖， 葡萄糖不耐受以及胰岛素耐药等体征， 而正常饮食组小鼠各项体征处于正常范畴。 随后， 将HFD 组和ND 组小鼠精子头部分别注射到正常卵母细胞中，在胚胎发育为个体后，均正常饮食。 HFD组子代在第7 周左右展现出葡萄糖耐受以及胰岛素抵抗力受损等表象，在第15 周时该表象愈发明显。 值得注意的是， 将HFD 组和ND 组精子RNA 提取纯化后分别注射至正常小鼠受精卵中， 得到的子代在正常饮食条件下，HFD 组子代出现血糖耐受性受损的表象，但对胰岛素的敏感性与ND 组子代相似。 该实验结果表明其中存在一种之前未注意到的RNA 影响传代遗传过程。通过转录组测序（RNA-seq）技术比较两个组子代RNA 发现，HFD 组子代相较于ND 组子代tsRNA 含量比例更高，miRNA 含量比例降低， 提示tsRNA 含量易受高脂肪饮食的影响。随后，将两组精子tsRNA 提纯并注入正常小鼠受精卵实验中，注入HFD 组tsRNA 的小鼠成功表达出胰岛素耐药的特征， 验证发现主要为代谢相关基因的表达下调，但具体机制仍有待研究。

RNA 修饰会对精子中tsRNA 的浓度和表达谱的变化产生较大的影响[7]。目前可以确定tsRNA 确实在表观遗传中起到重要作用。 表观遗传的调控按照步骤大致分为两个部分， 其一是父代将表观遗传信息储存在精子中， 其二则是子代对于遗传信息的提取过程，即tsRNA 如何通过生化反应途径对子代的代谢过程产生影响[20]。tsRNA 在精子中的丰度和可能存在的特殊结构是父代将环境产生的变化通过tsRNA 进行表观遗传的主要方式。 Chen 等证明，高脂饮食能够导致tsRNA 中的m5C、m2G 修饰的增加，也会影响tRNA 的稳定性，导致tsRNA 含量发生变化，从而介导表观遗传。 DNMT2是tsRNA 产生的重要酶之一，其发现过程也颇为曲折[21]，当科学家们终于意识到其作用位点位于RNA 而非DNA 之后[22]，才逐渐发现它的催化机制[23]。 而DNMT2敲除的小鼠不能将这种父代表型传递给子代， 相应的m5C、m2G 修饰也恢复到正常水平。 DNMT2 的缺失还可以改变精子小RNA 表达谱[16,17]。

tsRNA 也可介导F0 母本性状传递给F2 子代个体。 研究中发现，高脂饮食诱导组（HFD 组）的F0 雌鼠与正常雄鼠产下的F1 代雄性小鼠，正常喂养后提取其精子总RNA 注入到受精卵中， 产生的F2 代小鼠相较于正常饮食喂养组（control diet 组）F0 代雌鼠产生的F2代小鼠总体以及内脏脂肪含量更高， 同时在胰岛素耐受实验中也会展现出更高的血糖水平。 在高通量测量后发现，HFD 暴露组的F1 代雄鼠精子tsRNA 含量相较于CTR 组更高。 因此，HFD 暴露组的F0 代雌鼠与体现出胰岛素耐受、肥胖代谢综合征的F2 代小鼠之间的相关性以及与正常饮食组精子tsRNA 含量之间的比较，均表明“tsRNA 可以作为载体，促进了性状的跨代遗传”这一结论[19]。

五、精子tsRNA 对早期胚胎的调控

研究发现，tsRNA 除了在体内多种生理代谢过程具有重要的作用外， 其对于子代早期胚胎发育过程有关键的调控作用，而对这方面的进一步探究，有助于更加全面、深入地了解精子RNA 介导的表观遗传信息在父代与子代之间的传递。

2016 年，Chen 等[18]通过对雄性小鼠进行高热量饮食诱导，发现其子代相关基因表达明显异常，证明精子tsRNAs 的确对早期胚胎的发育过程起到了重要的作用。 2018 年，Luo 等[24]的研究发现，果蝇体内tsRNAs 可通过互补序列配对识别目标mRNA， 优先识别并结合核糖体蛋白(ribosomal proteins)和核糖体翻译启动或延伸因子(IEFs)mRNA，进行AGO2 蛋白依赖性的抑制调控，从而抑制靶基因的翻译。 同时，该研究还发现，在serum starvation 条件下的果蝇体内的5’tsRNA 而不是3’tsRNA 显著增加，导致RPs 和IEFs 的翻译合成降低[24]。2017 年，Schorn等[25]的研究发现，在模仿表观遗传重编程的GC-2spd, 小鼠精母细胞系和胚胎干细胞（embryonic stem cells）细胞中检测到了丰富的sRNA，其与LTR- 逆转录转座子或内源性逆转录病毒(Endogenous Retrovius)互补，可以干扰转座子发生转移，而这些sRNA 大部分来自tRNA，具有3’端CCA 核苷酸。 另一方面，该研究还发现，来源于tRNA3’端、长度为18nt 的tsRNAs 可以与ERV 共同竞争ERV 引物的结合位点(Primer Binding Site)， 如在LTR-逆转录转座子复制期间，PBS 与tRNA 结合， 且高度富集于两个最活跃的小鼠转座子家族inhibitor of apoptosis protein 和ETn，从而对ERV 逆转录起到特异性的抑制作用，同时也可以对反转座子迁移进行特异性地抑制[25]； 而来源于tRNA3’端、长度为22nt 的tsRNAs 则可以通过转录后sRNA 介导的沉默来抑制ERVs 的表达，但长度为18nt 的3’tsRNA 则对转录或蛋白水平没有影响[25]。 Conine 等提取附睾头部和尾部的精子并将其通过Intracytoplasmic sperm injectrtion（ICSI）分别注入至正常小鼠卵母细胞。 此项针对受精卵与胚胎的研究发现，在附睾头部精子含少量tsRNA 存在的情况下， 受精卵内部分调控因子过量表达，胚胎植入率和成活率低下。 同时，当精子在附睾经过一系列代谢调节后， 附睾尾部精子tsRNA含量比例增加， 所得到的受精卵与胚胎可正常进行生理代谢，植入率和存活率均达到正常标准。 随后，在验证实验中， 将tsRNA 纯化后的提取物注入到上述缺陷细胞中，各项生理指标又得到一定程度的改善。 由此判断tsRNA 在胚胎正常发育中也不可缺少[26]。

六、小结与展望

现有的研究发现可介导跨代遗传的非编码小RNA—tsRNA。 父代通过对RNA 以及剪切后的tsRNA进行特异性修饰， 完成精子介导的父代与子代之间的表观遗传信息传递。 在胚胎的早期发育过程中， 由于tsRNA 对转座子转移的抑制以及对核糖体合成的促进， 可对细胞分裂、 早期分化以及凋亡产生重要的影响。 然而，tsRNA 介导的表观遗传具体的分子机制仍有待于进一步深入研究。