生物钟基因在卵巢癌中的研究进展

俞元瑛，崔李宁

卵巢癌发病率在女性生殖系统肿瘤中位居第三，根据最新流行病学统计，2020年全球新发卵巢癌313 959例，其中死亡207 252例[1]，死亡率位居妇科恶性肿瘤之首。因缺乏有效、特定的筛查方法和能够早期诊断的方法，绝大多数卵巢癌患者在确诊时已为晚期，存在局部或远处转移，其5年生存率约为46%[2]。在治疗过程中，卵巢癌患者死亡的最主要原因为肿瘤复发和瘤体转移[3]。目前，对于卵巢癌的发病和转移机制尚不完全清楚，因此，探寻卵巢癌的发病和转移机制对其筛查、早期诊断及后续治疗意义重大。哺乳动物的活动具有昼夜节律，昼夜节律由生物钟控制，对生物钟而言，生物钟基因是其分子基础[4]。女性卵巢的生殖周期受昼夜节律的影响，本文就近些年生物钟、生物钟基因与卵巢癌的研究进展予以综述，并对今后的研究作出展望。

1 昼夜节律与生物钟及生物钟基因

在哺乳动物中，昼夜节律是机体内的一种生理现象，大约24 h为周期，使机体的生理过程与外界环境的变化相协调，是适应环境的一种表现，涉及机体多系统功能调控。

昼夜节律的产生和维持依赖于中枢及外周两个生物钟系统。哺乳动物的中枢生物钟位于视交叉上核（SCN）[5]，白天光信号通过视网膜下丘脑束传入，夜间松果体分泌出褪黑素进行反馈，以此调控昼夜节律[6]。外周生物钟则存在于全身大多数外周组织中，不仅可以被中枢生物钟调控，接受SCN的神经、体液或其他信号因子调控，也可自主运行，自行调控基因表达，这些基因表达与各组织特异性的功能相关[7]。两者共同作用，协调哺乳动物的生理活动，使之随昼夜交替，从而呈现节律性变化。

生物钟基因为生物钟产生、维持昼夜节律的分子基础[4,8]。目前研究发现，有十多个生物钟基因形成生物钟调控系统的负反馈转录翻译环路，包括Bmal1、Clock、Per、Cry、Ror、Rev-Erb、Tef、Dbp及Hlf等。Bmal1基因编码的蛋白质与Clock基因编码的蛋白质结合，可形成Bmal1/Clock异二聚体。白天时，转录因子Bmal1/Clock异二聚体进入细胞核内，结合到生物钟基因Per和Cry上游启动子的E-box元件，激活其转录。激活后，Per、Cry不断地被转录和翻译，于是在细胞质中，Per蛋白、Cry蛋白不断地生成、积累，同时与AMP活化蛋白激酶（AMPK）和酪蛋白激酶I（CKI和CKI）相互作用。夜晚时，Per与Cry复合物转移至细胞核内，在细胞核内与Dbox元件相结合，而D-box元件则位于Bmal1和Clock的启动子区域。该结合物不仅抑制Bmal1、Clock转录，还有负性调节功能。而后，Per蛋白、Cry蛋白在CKI、CKI的催化下，发生磷酸化和泛素化修饰反应而被进一步降解，随着Per蛋白和Cry蛋白降解，其抑制作用也随之消失。抑制作用消失后，Bmal1/Clock异二聚体便可再次表达，开始新的转录循环[9-10]。与此同时，核受体基因Ror/、Rev-Erb/启动子上的E-box元件，可与Bmal1/Clock异二聚体结合，随后促进Ror/、Rev-Erb/转录，生物钟基因转录翻译震荡机制的辅助环路由此启动。而Ror/、Rev-Erb/转录翻译的Ror/蛋白、Rev-Erb/蛋白，与Bmal1启动子区的受体应答元件可竞争性结合。在Bmal1的转录过程中，Ror/蛋白起促进作用，而Rev-Erb/蛋白起抑制作用。因此，Ror/和Rev-Erb/转录翻译的Ror/蛋白和Rev-Erb/蛋白，对生物钟主环路存在另一种调控作用[11]。

除了Bmal1、Clock、Per、Cry、Rev-Erb、Ror等这些目前研究较多的核心生物钟基因之外，还有一些钟控基因组成了另外的转录调控环路，比如E4bp4、Dbp、Hlf等转录因子家族。E4bp4基因是Rev-Erbs的靶基因，Dbp基因是Bmal1/Clock异二聚体的靶基因，两者可在细胞核内与Dbox元件结合，对Per基因表达进行调控[12]。Hlf基因有明显的节律性，可作为生物钟的输出调节剂，有抑制细胞死亡的作用[13]。

2 生物钟与卵巢

卵巢是女性产生、排出卵子并分泌甾体激素的性器官。目前研究表明，卵巢细胞中的生物钟在卵巢生理过程中发挥重要作用。卵巢的生殖周期受昼夜节律的影响，其节律性接受神经和内分泌组织的协调及同步活动。这种协调是由下丘脑-垂体-卵巢（HPO）轴各层面的基因表达和细胞生理学促进的。有研究报道在HPO轴的各组织中均已观察到生物钟基因的表达[14]，各层次的生物钟相互协调和同步，维持正常的生殖行为。昼夜节律的产生、维持和调控依赖连锁的转录-翻译反馈环路（TTFL），其决定着HPO轴每个组织中基因表达的周期和振幅。卵巢的生物钟接受SCN的神经内分泌调控，同时又具有自主性。

SCN能产生精氨酸加压素（AVP）和血管活性肠肽（VIP）。AVP信号对于GnRH神经元网络的视交叉上核调节同样至关重要。AVP受Bmal1/Clock复合物的调节,并以雌激素依赖的方式刺激Kisspeptin神经元[15]，Kisspeptin神经元接受刺激后分泌Kisspeptin多肽。Kisspeptin多肽在生殖中的主要作用是刺激促性腺激素释放激素（GnRH）神经元，该神经元则将GnRH释放到垂体-门脉系统中，GnRH促进垂体释放促卵泡激素和黄体生成素，两者进入血液，作用于卵巢，以促进接下来的生理活动[16]。VIP则可刺激GnRH神经元活动。HPO轴上各种生物钟相互协调和同步以促进正常生殖行为。

3 生物钟基因与卵巢癌的发生发展

相关研究显示，许多健康问题的发生率与生物钟的改变和破坏直接相关[17]，也有研究认为生物钟受到破坏引起的疾病，是由生物钟基因剂量变化和连锁的转录-翻译反馈环路中的基因剂量失去控制所致[18]。

卵巢肿瘤可发生于任何年龄，为常见的妇科肿瘤。其中恶性卵巢肿瘤早期病变不易被发现，晚期时缺乏有效的治疗手段，为妇科恶性肿瘤中致死率最高的疾病。卵巢的生物钟被打乱，或与其他部位生物钟的昼夜节律不同步，会导致各种生殖疾病的发生和发展，其中包括卵巢癌。

3.1 Bmal1基因与卵巢癌 Bmal1基因，也称作Arntl基因，在分子水平，是哺乳动物昼夜节律震荡器中的关键元件之一。它编码蛋白质Bmal1，位于11号染色体短臂，通过自身的表达调控、正负反馈通路和其他机制产生昼夜节律性。Bmal1基因不仅表达于所有视交叉上核细胞，在多数外周细胞中也存在表达[19]。

Bmal1基因编码的Bmal1蛋白通过与Clock基因编码的Clock蛋白结合后，形成Bmal1/Clock异二聚体，与Per、Cry等基因形成一个转录-翻译负反馈循环，在此反馈循环中Bmal1基因起到核心调控作用。在分子水平上，Bmal1基因参与肿瘤的发生，不仅表现在其发生异常之后导致正常细胞的细胞分裂、细胞周期和细胞凋亡异常，为细胞的恶变创造条件；还表现在该基因影响细胞侵袭性、肿瘤分期，与肿瘤进展密切相关。

在消化道、头颈、血液系统等肿瘤中，Bmal1基因是抑癌基因。有研究发现，沉默Bmal1基因会令癌细胞加速增殖。因为抑制Bmal1基因表达后，抑癌基因p53的表达随之受到抑制。p53基因表达受抑制，使细胞周期蛋白B1、D1和E合成受到促进，从而导致DNA损伤降低，细胞的凋亡减少，肿瘤细胞的增殖因此受促。实验表明，Bmal1过表达可抑制癌细胞增殖[20-21]。Jung等[22]通过实验发现，Bmal1基因可通过拮抗致癌基因Bclw、抑制PI3K-Akt-MMP-2信号通路，降低脑胶质瘤的侵袭性。同时Rana等[23]发现，Bmal1缺失后，转录下游与细胞增殖、凋亡相关的靶基因可缺失，慢性淋巴细胞白血病发病机制或与此相关。

在卵巢癌中，Bmal1基因起到抑制作用。Bmal1基因表达受抑后，p53的表达受到抑制，细胞周期蛋白D1合成增加，DNA损伤降低，细胞凋亡减少，肿瘤细胞便增殖。细胞周期蛋白D1是一种与细胞周期蛋白依赖性激酶4选择性相关的调节激酶亚单位，是细胞周期G1进展的关键调节因子[24]。有研究发现在卵巢癌患者中，细胞周期蛋白D1过表达，卵巢肿瘤中细胞周期蛋白D1的扩增很少发生[25]。因此，Bmal1基因过表达，对卵巢癌细胞增殖起到抑制作用。

3.2 Clock基因与卵巢癌 Clock基因在分子水平，也是哺乳动物昼夜节律震荡器中的关键元件之一。它编码蛋白质Clock，位于4号染色体长臂，通过自身的表达调控、正负反馈通路和其他机制产生昼夜节律性。Clock基因在下丘脑视交叉上核表达。

Clock基因编码的Clock蛋白通过与Bmal1基因编码的Bmal1蛋白结合形成Bmal1/Clock异二聚体，与Per、Cry等基因形成一个转录-翻译负反馈循环，在此反馈循环中Clock基因同Bmal1基因一样，有核心调控作用。此外，Matsuo等[26]通过研究发现，Clock能激活WEEL的启动子，使细胞分裂周期基因2磷酸化，导致其失活，抑制细胞G2/M期过渡，以此调控细胞周期。

Xu等[27]通过实验检测顺铂敏感A2780和顺铂耐药CP70细胞中Clock mRNA和蛋白的表达，发现与顺铂敏感的A2780细胞比较，后者Clock mRNA和蛋白表达均增加。而在敲除后者的Clock基因后，顺铂能够使细胞增殖受抑制，诱导细胞凋亡。该实验表明，Clock基因在癌细胞中的表达与顺铂耐药性有关。卵巢癌细胞中Clock基因的上调，可导致其对顺铂治疗的敏感性降低。

3.3 Per基因与卵巢癌 Per基因同为重要组成部分，有Per1、Per2、Per3等亚型，分别编码蛋白质Per1、Per2、Per3等，位于17号染色体短臂。实验发现，与正常组织相比，昼夜节律紊乱的卵巢癌患者肿瘤样本中，生物钟基因Per转录的Per1、Per2蛋白表达显著降低[28]。Per1、Per2蛋白对转录因子Bmal1/Clock异二聚体生成起负性调节作用，同时也抑制Bmal1基因和Clock基因转录[10]。

同时，Per1在不同的癌组织中存在差异表达，在各种卵巢癌中，Per1的表达均低于正常卵巢组织。根据统计，Per1基因低表达的卵巢癌患者，总体生存率低下。在I期和II期卵巢癌患者中，Per1表达降低与预后不良相关，而在III期和IV期患者中，Per1表达升高和p53突变与总体生存率和无进展生存率差相关。在卵巢癌患者中，Per1表达水平与包括中性粒细胞、调节性T细胞和M2巨噬细胞在内的细胞浸润水平呈正相关，并与多种免疫标记物密切相关。Per1表达降低与总体生存率低显著相关[29]。

有研究发现，Per2表达与卵巢上皮性肿瘤关系密切，随着肿瘤恶性期别升高，Per2基因表达逐渐减少或缺失。肿瘤组织的缺氧条件，可通过降解Per2引起上皮间质转化基因激活，使肿瘤出现高侵袭力。Per2可能是通过下调bcl-2基因，该基因是一种肿瘤凋亡抑制基因，从而促进凋亡基因bax表达，促使肿瘤细胞凋亡，进而抑制卵巢癌生长、转移，发挥抑瘤作用[30]。他们的实验还发现，Per2在局部持续高表达，可降低卵巢癌肿瘤组织中VEGF/VP表达，降低微血管的密度，说明其可能通过抑制血管新生来抑制肿瘤细胞的转移。Per2还可导致MMP-9和MTA-1表达显著降低，MMP-9和MTA-1与肿瘤侵袭性高度相关，进而抑制肿瘤浸润转移。在卵巢癌的移植瘤中，Per2基因过表达可降低PI3K/Akt通路蛋白表达，该信号通路的激活刺激肿瘤血管形成，细胞恶性增殖，促进肿瘤的发生和发展。由此推测，Per2基因通过抑制PI3K/Akt信号通路，凋亡异常细胞，进而抑制卵巢癌生长、转移，发挥抑瘤作用[31]。

4 生物钟基因与卵巢癌的诊疗

研究Bmal1、Clock、Per等生物钟基因表达与卵巢癌病理学指标等临床特征相关性，能够丰富肿瘤发生发展机制，为临床的卵巢癌预防、诊断提供新的思路。肿瘤时辰治疗是以人体正常的昼夜节律、不同时间肿瘤细胞的生长特性的差异为依据，将治疗方案个体化，从而降低药物毒性，提高治疗效果的一种治疗方式。肿瘤时辰化疗不仅已有所应用，且疗效甚佳。Levi等[32]发现，在相对应的时间对患者予抗肿瘤药物治疗，与错误时间给药或持续给药相比，根据时辰治疗的要求给药时，药物毒性反应可减少5倍。

相信随着对Bmal1、Clock、Per等生物钟基因的研究逐渐深入，根据昼夜节律制定卵巢癌患者的个体化治疗方案指日可待，对生物钟基因的研究将极大地提高肿瘤治疗效果，降低药物的不良反应。

5 展望与未来

不同的生物钟基因在卵巢癌中的作用各不相同，尽早明确各个生物钟基因的作用机制与卵巢癌的关系，不仅能帮助临床医生及时发现早期卵巢癌患者，还能指导临床优化卵巢恶性肿瘤患者的个体化治疗方案。