TLRs信号通路和TLRs的Cross-talk在炎症性疾病中作用的研究进展

蒋孙班,康思思,赵利娜,王 朝,蒋丽娜

（1.河北北方学院医学检验学院免疫教研室，河北 张家口 075000；2.河北省张家口市第二医院患者回访中心，河北 张家口 075000）

Toll样受 体（Toll-like receptors，TLRs）是模式识别受体（Pattern recognition receptor，PRR）的一种，由其家族成员内一系列蛋白分子组成，通过识别微生物共有的病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）和内源性的损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）传递的信号，进而通过通路下游一系列分子激活先天免疫和适应性免疫，从而发挥免疫调节功能。TLR的Cross-talk主要通过髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，My D88）和含TIR结构域的配体诱导β干扰素（TIR-domain-containing adaptor inducing interferonβ，TRIF）及其下游通路分子诱导，并在维持免疫稳态方面发挥相应功能［1］。研究［2-4］显示：TLRs与免疫细胞中存在的其他PRR（包括其他TLRs）、免疫分子和蛋白酶类之间存在Crosstalk，并在炎症的发生发展中起重要作用。TAN等［5］对TLRs及其Cross-talk在增加机体先天免疫的特异性中的作用进行了总结，认为TLRs的Cross-talk在自身免疫和免疫防御过程中发挥重要作用。本文作者结合近年来国内外相关研究，对TLRs信号通路及TLRs的Cross-talk在各种炎症性疾病发生发展中的作用进行综述。

1 TLRs及其信号通路

TLRs广泛分布于上皮细胞、淋巴细胞、树突状细胞、内皮细胞和巨噬细胞等细胞表面，分布于免疫器官和心、脑、肺、肝及肾等脏器组织中［6］，多与宿主防御功能有关［7］。TLRs是由细胞内Toll-白细胞介素1受体（Toll-interleukin 1 receptor，TIR）、胞外富含亮氨酸的重复性单位（leucinerich repeat，LRR）和跨膜区三部分构成的Ⅰ型跨膜蛋白组成，其胞外结构域可介导PAMPs分子的识别［8］，胞内结构域将受体的识别信号向下游转导［9-10］。细胞中定位合适的TLRs对于其配体亲和性及TLRs自身结构的维持和信号转导的激活至关重要。TLRs信号通路在调控免疫反应中发挥了重要的作用［11］。TLRs信号通路中MyD88是介导信号通路和先天免疫反应信号途径中重要的关键接头分子，也是机体内重要的信号传导蛋白。MyD88通过调控信号传导途径可实现其生物学功能［12］，MyD88的缺失可导致下游免疫相关信号的活化和失活及信号转导的中断，其也参与活化核转录因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号级联放大反应［13］。TLRs信号转导主要通过My D88、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和NF-κB的激活发挥功能［14］。因此，根据TLRs信号转导过程是否有My D88的参与，将TLRs信号转导通路分为依赖MyD88的TLRs信号转导通路和不依赖MyD88的TLRs信号转导通路［15-16］。而在2条通路的下游信号分子中，肿瘤坏死因子受体相关因子3（tumor necrosis factor receptor associated factors 3，TRAF3）和肿瘤坏死因子受体作用因子6（TNF receptor associated factors 6，TRAF6）是关键的节点。

1.1 MyD88依赖信号通路MyD88具有N端的死亡结构域和C端的TIR结构域［17］。在依赖MyD88的信号转导通路中，C端的TIR结构域和TLRs的TIR相互结合，N端死亡结构域和白细胞介素1受体相关激酶 （interleukin-1 receptor-associated kinase，IRAK）死亡结构域相互作用，MyD88募集IRAK结合，募集的IRAK自身磷化后脱离MyD88，与作为重要节点的TRAF6结合后，分化出NF-κB和JAK/APK 2条不同的信号传导途径，激活转化生长因子β活化激酶1（transforming growth factor-β-activated kinase 1，TAK1）和MAPK激酶6（MAP kinase kinase 6，MKK 6）的活化后转位而激活下游的NF-κB、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和MAPK的p38信号通路的转导，从而诱导白细胞介素1（interleukin-1，IL-1）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素12（interleukin-12，IL-12）和肿瘤坏死因子（tumour necrosis factor，TNF）等促炎细胞因子的分泌，自然杀伤细胞达到炎症的部位，进行消灭病原体，完成转导过程［18］。

1.2 My D88非依赖性信号通路MyD88缺失TLR4不缺失的小鼠树突状细胞仍可成熟。研究［15，19-20］显示：MyD88存在同源蛋白，也证实了MyD88非依赖信号通路的存在；同时其也被称为TRIF依赖途径，在TLRs家族中只存在于TLR3和TLR4的下游通路［21］。TRIF分别与TRAF6和TRAF3相互作用并招募下游分子，最终在细胞核中共同作用于NF-κB活化过程。研究［22］显示：该信号通路中LPS刺激可导致TRAF3招募的干扰素调节因子3（interferon regulatory factor 3，IRF3）的活化，进而对下游信号进行调节。MyD88同源蛋白有TIR结构域的连接蛋白（MyD88转接样蛋白，包括TIRAP和MAL），在TRIF依赖信号通路中也发挥着关键作用。研究［23］显示：另一种含有TIR结构域的衔接蛋白1（TIR domain containing adapter molecule-1，TICAM-1）可诱导产生IRF3，IRF3由羧基末端的丝氨酸和苏氨酸磷酸化协同调控完成转录的活性，病毒在自我复制过程中产生的dsRNA被TLR3识别活化TRAF6下游的TANK结合激酶1（TANK-binding kinase 1，TBK 1），使IRF3羧基末端的丝氨酸残基磷酸化，使其从细胞质中转移至细胞核中，磷酸化的IRF3和干扰素刺激的反应成分ISRES共同作用，诱导靶基因IFN和ISG56的激活及转录。可见在MyD88依赖信号通路和TRIF依赖途径中，TRAF3或TRAF6均作为重要的分子，使上游信号向不同方向正确传递。

2 TLRs的Cross-talk

TLRs通过结合入侵的病原体，并激发下游信号通路而在机体免疫中起关键作用，但TLRs受体本身无法完全赋予炎症属性和特征。反之，在炎症发展进程中，TLRs与不同的细胞内外信号分子结合并与其他调节途径发生Cross-talk的能力是决定炎症反应的类型、强度和持续时间的重要因素［24］。已有研究［24-27］显示：Fc受体（Fc receptor，FcR）、补体（complement，C）、PRR和一些信号分子通过与TLRs的Cross-talk调节，在细胞分泌炎性细胞因子与炎症进程等过程中起重要作用。一方面，上述分子被上游的病原体激活后，进而激活其下游的信号分子通路，通过与活化的TLRs下游通路产生协同作用或在某一水平上汇合，促进白细胞介素（interleukin，IL）和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）等细胞因子的释放，以加强免疫应答，促进T辅助细胞类别转换和减少病原体的免疫逃逸。另一方面，为防止炎症相关通路的过度激活或体内出现免疫抑制的微环境，某些信号分子会作为TLRs通路的抑制分子，通过下调TLRs的表达，干扰TLRs与配体的识别和抑制TLRs的信号转导来降低免疫应答。不过，这种Cross-talk作用具有两面性，功能正常时其在宿主的免疫防御中起重要作用，而在其功能紊乱时可能引发针对机体自身抗原的免疫应答、炎症失控甚至休克。

3 TLRs的Cross-talk与炎症性疾病

3.1 TLRs的Cross-talk与系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）SLE的病因及其发病机制尚不完全清楚，研究者［28］认为：SLE发病的主要原因为遗传与环境因素相互作用引起机体免疫功能紊乱，病原微生物感染人体诱导疾病发生。TLRs在类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等多种自身免疫性疾病的外周血单个核细胞中可被外源性的病原体和内源性的损害分子激活，导致核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）和干扰素调节因子（interferon regulatory factor，IRF）转入细胞核激活炎性细胞因子和趋化因子，使其在自身免疫性疾病中表达上调［29-30］。

已有研究［31］显示：许多细胞因子在SLE的发病过程中起重要作用，其中B细胞活化因子（B cell-activating factor，BAFF）被认为是其中具有代表性的细胞因子。同时，超过一半的活动性SLE患者在基因表达分析［32］结果中显示具有Ⅰ型干扰素明显升高的特点。而缺乏Ⅰ型干扰素受体的基因修饰小鼠的特征为对狼疮样疾病有高度抗性。SLE的特征之一为B细胞反应过度，而Ⅰ型干扰素是TLRs通路的下游产物，提示TLRs信号通路可能与B细胞的激活过程发生协同，通过降低B细胞反应的阈值增加B细胞的反应强度。研究［33］显示：B细胞中的BAFF通过结合跨膜激活物、钙调节物、亲环蛋白配体相互作用物（transmembrane activator and calcium modulator and cyclophilin ligand interactor，TACI），一种对于BAFF转基因小鼠中类别转换自身抗体的产生至关重要的受体，与TLR7下游中的MyD88通路发生协同，促进未成熟B细胞的类别转换和自身抗体的产生。抑制TLR7信号通路对TACI的影响有限，但足以减少自生抗体的产生。除此之外，浆细胞中TLR7信号通路也产生了类似效应。TLR7的功能增强可以引起生发中心（germ center，GC）自发形成和滤泡外体细胞高频突变，促进浆细胞分化，使自身免疫表型增加［34］。有研究［35］显示：对于维持GC结构至关重要的滤泡树突状细胞，在特异性狼疮中连接补体受体CD21结合补体形成自身免疫复合物后，通过TLR7途径表达Ⅰ型干扰素。该途径对于自发GC的形成和同型转换自身抗体的产生很重要。此外，TLR7和TLR9的Cross-talk在SLE的发病过程中起重要作用。UNC93B1蛋白是内质网的一种蛋白，NC93B1蛋白中不同的氨基酸与TLR7和TLR9结合，带有N端D34A突变的UNC93B1与TLR9正常相互作用，但与TLR7的相互作用较野生型UNC93B1强。增强的UNC93B1-TLR7结合增加了TLR7由内质网向内体的信号输出。这使得TLR9和TLR7在刺激抗体产生的过程中起相反的作用，即前者抑制了后者的促进作用［36］。TLRs作为模式识别受体之一，参与了B细胞相关的SLE的发病过程，但其具体的分子机制有待进一步研究。

3.2 TLRs的Cross-talk与急性肺损伤（acute lung injury，ALI）鉴于多种炎性介质和效应细胞共同参与ALI/急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的病理生理机制，已有越来越多的研究阐述TLR-TLR的Cross-talk在ALI发展中的作用。创伤患者出现ALI后，肺中的多形核中性粒细胞 （polymorphonuclear neutrophil，PMN）在内皮细胞（endothelial cell，EC）和巨噬细胞的参与下，经过一系列细胞事件后发生迁移，因其参与炎症的放大效应而作为ALI的 关 键 事 件［37］。研 究［38］显 示：PMN介 导 的TLR4-TLR2串扰的扩增加剧了炎症的程度。PMN中高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein，HMGB1）通过促进p47蛋白磷酸化和P47-GP91的组合，从而装配完整的NADPH氧化酶。NADPH氧化酶是一种高度可调节的膜结合酶复合物，其利用NAD（P）H作为电子供体，通过单电子还原氧来催化超氧化物的产生。核心酶由膜结合的蛋白（即gp91和p22）和胞质内蛋白（即p40、p47、p67和rac-1/2）组成［39］。NADPH氧化酶产生活性氧作为氧化剂，参与TLR下游的NFκB信号转导途径的增强。研究［37］显示：白细胞介素1受体相关激酶4（interleukin-1 receptorassociated kinase 4，IRAK4）（在TLR激活后，MyD88依赖性途径的下游成分）是ALI患者TLR2被氧化剂活化增强的作用靶点。氧化剂本身虽无法直接激活IRAK4，但可以放大脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的IRAK4激活。故IRAK 4可能是负责TLR4-MyD88信号传导的重要氧化还原调节激酶。还有研究［40］显示：HMGB1通过激活经典巨噬细胞（M 1）中的双链RNA活化蛋白激酶（double-stranded RNAactivated protein kinase，PKR）并通过TLR2和TLR4的Cross-talk介导的NF-κB信号通路诱导M 1极化，从而参与小鼠LPS诱导的ALI过程。可见HMGB1充当炎症的早期介质，通过TLR4-TLR2的Cross-talk导致出血后ALI的发展。有研究［41］显示：肺巨噬细胞（pulmonary macrophage，PM）中，TLR4-TLR3的Cross-talk亦会加重肺损伤，表明LPS通过TLR4-MyD88-NF-κB信号上调PM中TLR3的表达，而增加的TLR3导致MIP-2表达增强。MIP-2作为PM分泌的趋化因子，在PMN的迁移过程中起重要决定作用。除此之外，TLR3表达升高也增加了TNF和IL等炎性细胞因子的释放，进而促进PMN迁移，最终导致ALI。由此可见，TLR-TLR的协同放大可能是有害的，因其可能导致免疫过度激活，从而阻碍免疫稳态。因此，深入了解TLRs协同放大的机制可能有助于设计新的治疗策略，为预防和治疗严重的炎症反应提供依据。

3.3 TLRs的Cross-talk与脓毒症TLR4作为最主要的TLRs之一，在脓毒症的发病过程中起重要作用。IL家族分子与TLR4介导的败血症相关。有研究［42］显示：JAK/STAT和TLRs通路的Crosstalk是调节宿主全身炎症反应的重要机制。经由STAT 3的IL-6反信号通路激活以LPS为配体的TLR4及其下游通路，并反馈到MyD88/NF-κB途径中，从而驱动TLR4/LPS产生更多的IL-6，加重炎症。IL-6是重要的炎性细胞因子之一，IL-6通过与膜结合并相互作用，由酶水解产生天然可溶性白细胞介素6Ra（soluble interleukin-6Ra，sIL-6Ra），之后进行“反式传递”信号于gp130受体亚基，由gp130激活STAT 3，进一步正向调节MyD88而非TRIF通路，使小鼠对LPS的超敏反应加剧，加速脓毒症病理进程。还有研究［43］显示：依赖于IL-17受体的Sef/IL-17R（SEFIR）结构域与TLR的TIR结构域（构成STIR结构域超家族）在长度和二级结构上具有相似性，IL-17RD的SEFIR结构域可靶向抑制TIR适配器：MyD88、Mal、TRIF和TRAM，减少促炎因子的表达。另外，TLR4与补体的Cross-talk可引发细胞因子风暴导致脓毒症，其中补体C5和CD14的Cross-talk已被深入研究。CD14是一种结合蛋白，可促进LPS从LPS结合蛋白转移至TLR4-MD2复合物中，从而提高细胞对LPS的敏感性。研究［44］显示：补体C5和TLR受体CD14的双重阻断，可能通过抑制C5a介导的TLR4下游MAPKs和JNK通路，最终提升实验性败血症者的存活率。不过，TLRs与其他模式识别受体的Cross-talk可能有利于改善脓毒症患者的症状。研究［45］显示：清道夫受体（scavenger receptor，SR）通过抑制TLR4下游通路TRAF6的泛素化，减少NF-κB的激活及其随后产生的一系列炎症反应。TLR和核苷酸寡聚化结构域样受体（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLR）信号之间的Crosstalk导致TNF-α和IL-6启动子的NF-κB增强激活，增强炎症性细胞因子的分泌并加速细菌清除，从而预防多发性脓毒症［46］。有研究［47］显示：一种免疫负调节剂，T细胞免疫球蛋白黏蛋白3（T-cell immunoglobulin and mucin domain 3，Tim-3）通过促进胞内磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidyl inositide 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）的磷酸化和A 20活性来抑制LPS-TLR4介导的NF-κB活化，以抑制巨噬细胞的过度激活和引导内毒素耐受。A 20是一种维持内毒素耐受增加的锌指蛋白，而PI3K-AKT是介导巨噬细胞活化的关键途径。鉴于不受控制的巨噬细胞活化可能导致过度的炎症反应和败血症患者存活率降低，尽管其具体机制尚不清楚，但Tim-3的免疫抑制作用可视为败血症患者的一种新的适应性补偿和保护机制。研究［48］显示：肺泡上皮细胞中TLR2与TLR4的Cross-talk既加重败血症，又引发ALI。可见TLR2与TLR4协同作用对炎症疾病进程具有重要影响。

4 小结和展望

TLRs的Cross-talk作为先天性免疫和适应性免疫的桥梁，在病原体被模式识别受体识别加工后产生的病理生理学效应中发挥重要作用。TLRs的Cross-talk类型众多，在各种炎症性疾病中产生包括细胞凋亡、免疫抑制和免疫过激等多方面的效应，这种效应在宿主中普遍存在，只是作用强弱不等。尽管已发现众多TLRs的Cross-talk组成、功能和信号通路，但同一分子基础和功能的TLRs的Cross-talk产生的不同生物化学变化及这种变化如何调节信号传导值得进一步研究。另有研究［47］显示：免疫抑制剂在抑制TLRs的Cross-talk引发的过度免疫应答过程中起重要作用，可作为今后研究的重点。

综上所述，以TLRs的Cross-talk作为研究靶点，研究其在炎症相关疾病发生发展中的分子机制，可为相关疾病的诊断、预防和治疗提供理论依据。