中国传统食品酵母菌在谷物制品中的应用研究

杨海莺，赵 凯，杨书林，高嘉星，牛兴和，李 慧✉

（1. 中粮营养健康研究院有限公司，营养健康与食品安全北京市重点实验室，老年营养食品研究北京市工程实验室，北京 102209；2. 中粮粮谷控股有限公司，北京 100020）

酵母菌在发酵谷物制品中扮演重要角色，影响制品的质构、香气等。具体作用如下：①提供各种酶系，如蛋白酶、蔗糖酶、淀粉酶、脂肪酶等[1]，分解谷物中的麦芽糖、蛋白、糊精等，提升面团的加工性能。②分解单糖、双糖、三糖[2]，产生CO2，影响谷物制品的外观质构指标，包括高径比、比容、色度、切面气孔、硬度、弹性等。③产生酯类、醇类等多种芳香物质，赋予制品独特香气[3]。④营养方面，酵母菌提供氨基酸（Tyr、Lys）[4]、维生素[5]等，降低谷物中的植酸，提高谷物矿物质、蛋白质的生物利用率。

商业酵母在我国发酵面制品领域的广泛应用，实现了多种发酵面食的规模化。但随着产业的成熟，发酵面制品的品类和质量越来越趋于同质化。我国不同地区的传统天然发酵老面或面种，能够为发酵谷物制品提供有特色的风味、质地。通过从我国传统发酵食品中挖掘酵母菌资源，有助于改善产品感官品质、提供独有的发酵风味、延缓面制品老化以及延长保质期，形成具有丰富特色的蒸煮面食、烘焙制品、冷冻面团等差异化的谷物产品，满足我国日益增长的消费者需求。

1 材料与方法

1.1 实验材料

商业酵母：安琪即发性活性干酵母；葡萄糖（分析纯）：国药集团；蛋白胨、酵母浸粉、琼脂、WL琼脂培养基：北京陆桥公司；大麦麦芽：中粮麦芽（大连）有限公司；黄油：安佳；面粉、糖、盐、鸡蛋：市售；E×Taq酶、dNTPs Mixture、10×Buffer I：TaKaRa 公司；真菌 DNA 提取试剂盒：天根生化科技公司。

1.2 仪器与设备

SMF-16醒发箱：新麦公司；TA-XT Plus质构仪：英国 SMS公司；WH-11生化培养箱：德国Wiggens公司；J-26S XPI高速冷冻离心机：美国贝克曼公司；ACB-4A1生物安全柜：新加坡ESCO公司；MULTISKAN SKY酶标仪：美国赛默飞世尔公司；Ka7580和面机：美国kitchenAid公司；急速冷冻柜：科麦机械公司；JMTY体积测定仪：中储粮；HP23-AW-40水分活度仪：瑞士 Rotronic；DLFU粉碎机：瑞士布勒公司；ZHWY-111C恒温摇床：上海智诚公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种分离

将样品用无菌生理盐水振荡稀释，选取合适的稀释倍数，将稀释液涂布于 WL琼脂培养基（Wallerstein Laboratory agar medium），28 ℃培养2 d，挑取单菌落于WL培养基平板上划线纯化 3次，经镜检为纯种后转入酵母膏胨葡萄糖（Yeast Extract Peptone Dextrose, YPD）琼脂培养基（酵母浸粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂20 g/L）待用。

1.3.2 菌种鉴定

将单株酵母菌接种在YPD液体培养基中，在28 ℃、150 rpm震荡培养至菌液吸光值OD600达1.0以上。按照真菌DNA提取试剂盒说明书操作，提取酵母基因组后用超微量紫外分光光度计检测浓度和纯度。使用引物 ITS1（5ʹ-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3ʹ）和 ITS4（5ʹ-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3ʹ）PCR 扩增 ITS 基因序列。PCR反应体系：ddH2O 33.75 μL、10×Buffer 5 μL、dNTPs4 μL、引物各 2.5 μL、Taq 酶 0.25 μL、DNA模板2 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性 30 s，53 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 40 s，35个循环，再72 ℃延伸10 min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，目标条带为600 bp左右，之后送至北京新时代众合科技有限公司进行测序。将获得的有效序列与美国国立生物技术信息中心的数据库进行比对。

1.3.3 菌株发酵性能测定

1.3.2.1 麦汁培养基制备 将麦芽粉碎后，加入8倍质量的65 ℃去离子水，在不断搅拌下于65 ℃水浴中保温60 min，冷却后过滤，所得上清即为麦汁培养基。

1.3.2.2 发酵力 将酵母菌接种至麦汁培养基中，28 ℃摇床培养至菌液吸光值OD600达1.0以上。量取23.5 mL菌液与50 g面粉、7.5 g白砂糖混合均匀，揉制成面团，置于250 mL量筒中，按压面团使量筒内不留空隙，保证面团表面平整，置于35 ℃醒发箱中，每隔30 min记录一次面团达到的量筒刻度数，记录3 h内面团体积的增加值。

1.3.2.3 耐高糖性能 将白砂糖添加至 YPD 液体培养基中，使其糖浓度分别为10%、20%、30%和 40%。将酵母菌接种至不同糖浓度的 YPD液体培养基中，28 ℃、150 rpm摇床培养，分别在培养0、2、4、6、9、24、26、30 h时取样测定菌液吸光值OD600。

1.3.2.4 耐热性 将酵母菌接种至 YPD液体培养基中，分别置于 28、37、40 ℃摇床培养，分别在培养0、2、4、6、9、24、26、30 h时取样测定菌液吸光值OD600。

1.3.4 酵母应用实验

1.3.4.1 馒头制备方法 酵母菌用麦汁培养基培养至吸光值OD600达1.0～1.3。量取141 mL菌液与300 g面粉混合均匀，搅拌8～10 min，将面团分块后成型，每块约 130 g，置于 35 ℃醒发箱1.5 h后取出二次成型，再次醒发40 min后蒸制25 min即可。

1.3.4.2 吐司面包和冷冻面团制备方法 酵母菌用麦汁培养基培养至吸光值OD600达1.0～1.3，离心收集酵母泥沉淀，测定水分、活菌数量，置于4 ℃冷藏备用。

吐司面包和冷冻面团参照表1中的配方制备，用含同等数量级活菌的酵母泥替代商业酵母粉，并基于酵母泥的水分含量，减少配方中的水添加量。

表1 面包配方Table 1 Bread recipe g

吐司面包工艺为：配料称重→搅打面团→静置→切块、搓圆→静置→排气整形→静置→二次整形→醒发→烘烤。

冷冻面团工艺为：将面团二次整形结束后，置于速冻箱内1.5 h，待面团中心温度降至–12 ℃后，取出置于–20 ℃冻存。

1.3.5 发酵面制品性能测定

1.3.5.1 比容 熟制好的样品冷却1 h后，参照GB/T 21118—2007[6]方法测定比容。

1.3.5.2 高径比 用游标卡尺测量样品的高度、直径，高径比即为高度与直径的比值。

1.3.5.3 质构特性 参考文献方法[7]并改进。熟制后的样品放置冷却1 h后，取两片12.5 mm的样品切片叠加，选用质构仪的P/36R柱形探头。测试前速率：1.0 mm/s；测试中速率：1.0 mm/s；测试后速率：1.0 mm/s；测定间隔为5 s；压缩率为50%；触发类型设置为：Auto；起点感应力：5 g。

1.3.5.4 感官评定 馒头感官评分打分标准见表2[8]，面包感官评分打分标准参考 GB/T 35869—2018附录A[9]。

表2 馒头感官品评打分标准Table 2 Scoring standard for sensory evaluation of steamed bread

1.3.5.5 水分活度 将样品整片用粉碎机粉碎，用水分活度仪测定水分活度。

1.3.5.6 冷冻面团活力 冷冻面团每周取一次样，于4 ℃过夜解冻后，置于37 ℃醒发箱内，待面团体积膨胀至2倍大时取出，记录醒发时间。将醒发好的面团置于烤箱内烘熟，冷却1 h后按1.3.5.1的方法测定比容。

1.4 数据分析

实验做3次重复，用Excel软件计算标准偏差并作图，用 SPSS16.0 数据处理软件进行方差等数据分析。

2 结果与讨论

2.1 菌种的分离及鉴定

2.1.1 菌种的分离筛选

从不同省市采集的传统老面、天然面种样品中分离获得了 65株菌株，其中来源于老面的有45株，来源于天然面种的有20株。菌落呈乳白色，表面光滑，形状为圆形或椭圆形。

2.1.2 菌种鉴定

将菌株的测序结果在 NCBI 中使用 BLAST进行同源性比较，结果分离的65株菌均与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的同源性最高，均为酿酒酵母。

2.2 菌株发酵性能评估

2.2.1 发酵力

不同酵母在面团中的发酵力对比如表3所示。

表3 酵母面团不同发酵时间的体积Table 3 Volume of yeast dough at different fermentation times mL

续表3

发酵力是衡量面制品用酵母质量的最重要指标。酵母发酵力体现在适当的醒发温度下，按一定配方配制的面团在规定时间内经酵母发酵产生的CO2气体的量[10]，通常可由面团的体积变化率来表征。以商业酵母为对照，不同酵母菌制备的面团，均随发酵时间的延长，体积逐渐增加。相比初始体积，能够使体积膨胀到2倍以上的酵母发酵力较强。

2.2.2 耐受性

从分离自天然面种的20株酵母菌株中，筛选到可使含糖面团体积在3 h发酵到2倍以上的8株酵母，验证其耐糖性和耐热性。

如图1所示，优选的8株酵母均能耐受30%的糖浓度，但在40%糖浓度中吸光值OD600低于空白对照，说明酵母菌不能耐受40%的糖浓度。谷物用酵母主要分为用于含糖量在 15%～30%的高糖面团的耐高糖酵母，以及用于含糖量小于7%的面团的低糖酵母[11]。前者用于面包等烘焙甜品，后者多用于馒头、饺子、包点等蒸煮类面制品。本研究筛选出的耐高糖的酵母，均可以在30%糖浓度的体系中正常生长，可保证其在高糖烘焙制品制作过程中保持良好的发酵特性。

图1 天然面种来源酵母菌株耐糖性Fig 1 Sugar tolerance of yeast strains from natural flour species

如图2所示，优选的8株酵母在37、40 ℃可正常生长，耐热性好。传统酿酒酵母的最适生长温度为25～33 ℃ ，一般不超过36 ℃[12]。本研究筛选出的酵母能够适应更广的生长温度，便于活化和扩大培养，有利于开发制备高温喷粉菌剂。

图2 天然面种来源酵母菌株耐热性Fig 2 Heat tolerance of yeast strains from natural flour species

2.3 馒头应用性能评估

2.3.1 比容

从来源于老面的45株酵母中，筛选可使面团体积在3 h发酵到2倍的34株酵母进行馒头应用实验。经过比容测定，有32株酵母制备的馒头样品满足国标要求的比容≥1.7 mL/g，其中 Y80、Y88、Y89和Y147最佳，以Y147最为突出。

2.3.2 高径比

酵母菌的产气能力有差异，会对馒头醒发熟制后的形态产生不同的影响。以高径比来评估馒头的体积膨胀程度[13]。如表4所示，以商业酵母（A）为对照，有 5株酵母馒头的高径比不如商业酵母，其余29株均优于商业酵母，其中以Y71、Y97和Y100为最佳。

表4 不同酵母馒头的比容和高径比Table 4 Specific volume and high diameter ratio of steamed buns made of different yeast

2.3.3 感官评分

评分小于70分判定为差，70～79分为一般，80～89分为良好，大于90分为优。

如表5所示，商业酵母（A）制备的馒头和5种酵母馒头 Y89、Y94、Y97、Y146和 Y147均在80分以上，达到了良好的标准。

表5 不同酵母馒头的感官评分Table 5 Sensory evaluation scores of steamed buns made of different yeast 分

续表5

2.3.4 质构

硬度值、弹性值反映样品的口感品质，硬度数值越大，样品吃起来就越硬，缺乏弹性、绵软、爽口的感觉；弹性数值越大，样品吃起来柔软又筋道、爽口不黏牙。不同样品的硬度、弹性指标对比见表6。

表6 不同酵母馒头的硬度和弹性Table 6 Hardness and elasticity of steamed buns made of different yeast

续表6

由表6可知，与商业酵母（A）相比， Y146和Y147具有较低的硬度，口感柔软细腻。此外，Y80、Y88和Y102也具有相对低的硬度。

通过表6可知，商业酵母（A）制备的馒头样品在第一次压缩后能够再恢复90%的程度，其他受试的酵母有43株的弹性均优于商业酵母，其中Y88、Y89可达到95%左右。

2.3.5 综合评估

综合不同酵母制备馒头的质量指标，优选出5株适合用于蒸煮类面制品的酵母菌株，分别为Y88、Y89、Y97、Y146 和 Y147。

2.4 吐司面包应用性能评估

将来源于烘焙用天然面种的8株耐高糖、耐热酵母进行吐司面包应用验证。以商业酵母为对照，评估不同酵母对吐司水分、质构、切面外观的影响。

2.4.1 水分活度

由表7可知，面包放置过程中，不同酵母菌对吐司面粉水分活度影响不大。

表7 不同酵母菌对吐司面包保质期内水分活度的影响Table 7 Effects of different yeasts on water activity of toast during shelf life

2.4.2 质构

由表8～9可知，面包放置过程中，分离自天然面种的酵母制备的吐司面包普遍硬度低于商业酵母面包。Y220酵母面包硬度、咀嚼性较高。Y199、Y222面包的质构指标与商业酵母较接近。

表8 酵母Y199、Y204、Y209、Y214制备吐司面包保质期内全质构分析Table 8 Full texture analysis of toast bread made of yeasts Y199, Y204, Y209 and Y214 during shelf life

表9 酵母Y210、Y212、Y220、Y222吐司面包保质期内全质构分析Table 9 Full texture analysis of toast bread made of yeasts Y210, Y212, Y220 and Y222 during shelf life

2.4.3 感官评价

由表10～11可知，Y214样品面包弹性、放置两天纹理撕裂性表现最优。Y204面包切片的纹理拉丝性、切面气孔均匀性最优。Y212面包纹理拉丝性、切片气孔均匀程度、放置两天撕裂性表现均最优，Y210面包的弹性最优。

表10 酵母Y199、Y204、Y209、Y214吐司面包感官评分排序Table 10 Sensory score ranking of toast bread made of yeasts Y199, Y204, Y209 and Y214

表11 酵母Y210、Y212、Y220、Y222吐司面包感官评分排序Table 11 Sensory score ranking of toast bread made of yeasts Y210, Y212, Y220 and Y222

2.4.4 综合评估

综合不同酵母吐司面包的质量指标，优选出4株适合用于烘焙类面制品的酵母菌株，分别为Y204、Y210、Y212 和 Y214。

2.5 冷冻面团活力评估

从优选的4株适合用于烘焙类面制品的酵母菌株中，挑选使含糖面团发酵3 h后体积较大、发酵力强的 2株酵母 Y204、Y214，进行冷冻面团应用验证。

以酵母 Y214、Y204、商业酵母为发酵剂制备餐包冷冻面团，速冻后置于–20 ℃冻存，定期监测冷冻面团的发酵活力，评估面团醒发烘烤后的比容。

冷冻面团随着冻存时间的延长，其醒发、烘烤后的比容有降低的趋势，直至无法醒发膨胀至正常体积，活力丧失，这些现象主要是酵母活力下降导致的[14]，一方面低活力酵母的活细胞数减少，产气力降低，不能维持面团正常的醒发体积；另一方面，酵母细胞膜冷冻损伤后，释放出的还原性物质（例如谷胱甘肽）会弱化面筋，从而减弱面团的持气力[15]。选择活力较高的抗冻酵母品种是维持冷冻面团品质的关键。由表12可知，与商业酵母对比，Y204、Y214酵母的抗冻性较强，制作的冷冻面团冻存35天依然能正常醒发。且Y204、Y214制备的冷冻面团餐包的比容和挺立度均优于商业酵母。其中Y214酵母的抗冻性最优。

表12 酵母冷冻面团存放期内比容变化Table 12 Specific volume change of yeast frozen dough during storage

3 结论

本研究从我国不同省市的老面、天然面种中分离得到65株酵母菌株。在以馒头为代表的蒸煮类发酵制品的应用中，通过分析比容、高径比、质构数据以及结合感官品评结果优选出 Y88、Y89、Y97、Y146和 Y147五株酵母。在以吐司面包为代表的烘焙类发酵制品的应用中，通过分析水分、质构、感官品评结果优选出Y204、Y210、Y212和Y214四株酵母。其中Y204、Y214的抗冻性强，能够使冷冻面团的活力维持28天以上。

可结合各种酵母的不同特色进行复配，发挥各自最大的优势，开发特色酵母发酵剂，为消费者提供差异化的烘焙和蒸煮面制品。此外，延长冷冻面团活力的抗冻酵母的发掘有助于提升冷冻面团稳定性，是冷冻面团技术体系中不可或缺的重要部分，该技术使面团制作环节与成品熟制售卖环节独立开来，在强化产品标准质量的同时扩大供应范围。本研究筛选的抗冻性强的酵母具有在冷冻面团中应用的潜力，对于加工符合我国文化特点的冷冻面制品、推动我国发酵面食工业化进程、满足消费者多样化需求具有重要意义。