细菌耐药基因检测结果与药敏试验结果的一致性分析

李纯，叶俊琴，黎四平（通信作者）

1 广东医科大学 （广东东莞 523808）；2 广东医科大学附属东莞市儿童医院 （广东东莞 523325）

病原菌是引起人体感染的主要因素之一。近年随着抗菌药物、侵入性操作等在临床的广泛应用，促使细菌的耐药性呈不断上升趋势，并产生多重耐药菌，而由此类病原菌诱发的感染已成为临床较为棘手的问题[1-2]。大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌等为临床常见病原菌，是引起人体感染的常见革兰阴性菌。由于广谱抗菌药物的广泛应用，使得细菌产超广谱β-内酰胺酶的检出率逐年升高，临床治疗难度增加[3-4]。因此，及时明晰此类病原菌的耐药基因分布情况与药敏试验结果之间的关系，对于指导临床规范选用抗菌药物意义重大。基于此，本研究分析细菌耐药基因检测结果与药敏试验结果的一致性，以指导临床合理用药，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般材料

选取2020年2月至2021年4月医院临床各科送检的住院患者的标本，包括痰液、血液、尿液等。

1.2 方法

细菌培养：将痰液、尿液等标本置于无菌容器内，血液标本置于血培养瓶内，严格按照《全国临床检验操作规程》[5]进行细菌培养，将获取的标本分别对应接种于巧克力琼脂平板、血琼脂平板上进行初步细菌培养，之后放入孵箱内培养24～48 h，待细菌长成菌落后挑取单个菌落采用VITEK 2 COMPACT 全自动微生物鉴定系统进行药敏试验。

耐药基因检测：依据大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、屎肠球菌的常见耐药基因头孢噻肟酶（cefotaximase，CTX-M）序列进行特异性引物与引物序列设计，采用煮沸法提取核酸，即将细菌准确接种在LB 营养琼脂平板上，放入培养箱（设定温度为35 ℃）内过夜培养，次日挑选单个菌落，借助LB 营养琼脂平板开展分离纯培养，第3 天取菌落数个放入EP 试管（内含双蒸水）中并蒸煮10 min，而后取200 μl 菌液，以13 000 r/min 离心5 min，获取上清液，在上清液中加入50 μl 0.9%氯化钠溶液，重新悬浮，再以13 000 r/min 离心3 min，获取上清液，加入200 μl 0.9%氯化钠溶液，之后以95 ℃煮沸10 min，以13 000 r/min 离心3 min，获取上清液，由深圳华大因源医药科技有限公司检测耐药基因，以细菌耐药基因CTX-M 型阳性为检测出基因型，阴性即为未检测出基因型。

1.3 观察指标

以聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）法检测大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、屎肠球菌的基因型（CTX-M 型）分布情况，并比较细菌耐药基因检测结果与药敏试验结果的一致性。

1.4 统计学处理

采用SPSS 18.0 统计软件进行数据处理，计量资料以±s表示，采用t检验，计数资料以率表示，采用χ2检验，一致性采用Kappa检验，Kappa<0.40 表示一致性不佳，0.40～0.74 表示一致性尚可，>0.74 表示一致性良好，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大肠埃希菌耐药基因检测结果与药敏试验结果的一致性分析

354 株大肠埃希菌中，CTX-M 型339 株，占比95.76%（339/354），未检测出基因型13株，占比3.67%（13/354），≥2 种基因型2 株，占比0.56%（2/354）；大肠埃希菌耐药基因检测结果与药敏试验结果一致性良好（Kappa=0.778，P=0.000），见表1。

表1 大肠埃希菌耐药基因检测结果与药敏试验结果的一致性分析

2.2 肺炎克雷伯菌耐药基因检测结果与药敏试验结果的一致性分析

82 株肺炎克雷伯菌中，CTX-M 型74 株，占比90.24%（74/82），未检测出基因型1 株，占比1.22%（1/82），≥2 种基因型7 株，占比8.54%（7/82）；肺炎克雷伯菌耐药基因检测结果与药敏试验结果一致性较为尚可（Kappa=0.491，P=0.000），见表2。

表2 肺炎克雷伯菌耐药基因检测结果与药敏试验结果的一致性分析（株）

2.3 粪肠球菌耐药基因检测结果与药敏试验结果的一致性分析

24株粪肠球菌均未检测出基因型；粪肠球菌耐药基因检测结果与药敏试验结果一致性不佳（Kappa=0.188，P=0.122），见表3。

表3 粪肠球菌耐药基因检测结果与药敏试验结果的一致性分析（株）

2.4 屎肠球菌耐药基因检测结果与药敏试验结果的一致性分析

12株屎肠球菌均未检测出基因型；屎肠球菌耐药基因检测结果与药敏试验结果一致性不佳（Kappa=0.143，P=0.593），见表4。

表4 屎肠球菌耐药基因检测结果与药敏试验结果的一致性分析（株）

3 讨论

随着临床抗菌药物的大量使用、介入性诊疗手段的广泛使用以及各种免疫抑制剂的运用增多，促使各类病原菌的耐药性增加，并呈现出多重耐药，进而增加了感染控制难度[6]。多重耐药菌的产生不仅严重影响感染性疾病的控制和治疗，而且还会延长患者的住院时间，给其身心健康造成较多影响[7-8]。另外，不同国家和地区抗菌药物使用的种类、数量和习惯的不同，导致病原菌的基因型分布呈明显的区域特征[9-10]。因此，及时准确掌握临床病原菌的耐药基因分布情况以及与药敏试验结果的一致性，对于指导临床合理选择、科学使用抗菌药物具有重要意义。

本研究结果显示，354 株大肠埃希菌中，CTX-M型339 株，占比95.76%（339/354），未检测出基因型13 株，占比3.67%（13/354），≥2 种基因型2 株，占比0.56%（2/354）；大肠埃希菌耐药基因检测结果与药敏试验结果一致性良好（Kappa=0.778，P=0.000）；82 株肺炎克雷伯菌中，CTX-M 型74 株，占比90.24%（74/82），未检测出基因型1 株，占比1.22%（1/82），≥2种基因型7株，占比8.54%（7/82）；肺炎克雷伯菌耐药基因检测结果与药敏试验结果一致性较为尚可（Kappa=0.491，P=0.000）；提示多数的产超广谱β 内酰胺酶类的大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌为CTX-M 基因编码所致，而且有多株同时携带2 种及以上的基因型，分析原因可能与临床上长期大剂量使用头孢曲松等第三代头孢菌素诱导耐药细菌产生与传播联系密切[11-12]；此外，还提示大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌的耐药基因检测结果与药敏试验结果具有良好的一致性，临床可根据细菌耐药基因检测结果选择最佳的抗菌药物。本研究结果显示，24 株粪肠球菌均未检测出基因型，粪肠球菌耐药基因检测结果与药敏试验结果一致性不佳（Kappa=0.188，P=0.122）；12 株屎肠球菌均未检测出基因型，屎肠球菌耐药基因检测结果与药敏试验结果一致性不佳（Kappa=0.143，P=0.593）；原因可能与此类病原菌纳入样本量较少有关。

综上所述，大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌对头孢塞肟的耐药性较为严重，且耐药基因检测结果与药敏试验结果具有良好的一致性，临床可根据细菌耐药基因检测结果选择最佳的抗菌药物。