自然高温条件下百合叶绿素荧光特性分析

陈敏敏，聂功平，李 心，周 琳，杨柳燕，张永春

（上海市农业科学院林木果树研究所，上海市设施园艺技术重点实验室，上海201403）

0 引言

百合是百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)重要的球根类植物，已报道有55个种和18个变种分布于中国，其花色丰富，观赏价值极高。随着城市园林绿化的发展及花卉产业的转型升级，百合的消费模式向小型盆栽、室外庭院装饰及家庭园艺等消费形式拓展。百合喜冷凉湿润型气候，而中国长江中下游以南地区夏季普遍存在高温高湿等气候因素，影响百合的生长发育和品质，一定程度上制约了其园林景观的应用与家庭园艺推广，因此，研究百合自然高温逆境下的响应机制和不同品种对高温逆境的敏感性，对于提高百合耐热性、保证植株正常越夏及选育耐热性强的品种具有重要意义。

前人关于百合对高温逆境研究已有部分报道，大多集中于提高种球耐热性的方法、部分品种耐热性生理指标测定、EMS诱变选育耐热品种及耐热相关基因的挖掘与分子生物学研究，如刘雪凝等[1]以‘多安娜’为试材开展热激锻炼对亚洲百合耐热性的诱导相关研究，推断种球热激锻炼30 min为提高其耐热性的有效时间；李蕊等[2]开展百合杂交种及其亲本的耐热性比较分析，结果表明‘细叶百合’大庆种源较承德种源的耐热性强，杂交种的耐热性与母本相近；刘艳妮等[3]开展35℃高温条件下筛选‘铁炮百合’EMS诱变后的耐热突变体，较对照耐热性增强；张铭顺等[4]以东方百合杂种系‘西伯利亚’为材料研究表明高温胁迫下，外源Ca2+能通过提高渗透调节能力、抗氧化能力、光合作用能力和蛋白活性来调节其对高温逆境的适应性；Xin等[5]、Wu等[6-7]克隆‘麝香百合’中的热胁迫转录因子HsfA2、HsfA3和DREB2-type，并在拟南芥中验证其相应功能。在植物高温逆境评价方面，张佳平等[8]利用隶属函数法结合主成分分析法对10个芍药品种的耐热性展开评价，隶属函数法是芍药耐热性评价简便、直观、有效的评价方法；王海珍等[9]采用模糊数学的隶属函数对胡杨异形叶叶绿素荧光特性对高温的响应进行综合评价，表明锯齿阔卵形叶的耐热性最强。

高温对植物生长发育的负面影响大，其中光合作用是植物面对胁迫时最为敏感的生理过程。叶绿素荧光动力学技术在测定植物叶片光合作用过程中光系统对光能的吸收、传递、分配等方面具有优势，已成为研究植物光合生理功能及各种逆境胁迫下鉴定评价植物抗性的理想技术[9-10]。不同植物在高温胁迫情况下，其基因转录表达、生理指标及表型性状均会随着植物耐热性的大小呈现差异，一般可以通过抗性基因表达分析、生理指标的检测及表型性状的变化来鉴定不同植物品种的耐热性。但由于抗性基因定量分析和生理指标的检测操作较复杂，尤其需要评价的品种较多时，需耗费大量的人工和财力，因此，采用叶绿素荧光参数指标建立简单快速的耐热性状评价体系可在短时间内针对大量品种进行鉴定，方法简便、快速、准确。本研究在上海夏季自然高温逆境条件下收集66个观赏百合品种的叶绿素荧光特征参数，针对不同品种对自然高温逆境的反应进行综合分析和评价，以期对不同百合品种的高温逆境敏感性开展评价，为百合高温逆境响应相关机理研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用百合材料由上海市农业科学院收集保存，共计66份。包括包括LA(Longiflorum×Asiatic)系18份，LO(Longiflorum×Oriental)系2份，A(Asiatic)系18份，O(Oriental)系19份，OT(Oriental×Trumpet)系8份，LL(L.longiflorum×L.pardalinum)杂交系1份（表1），种球围径均为14～16 cm，材料分别于2019年4月30日种植于上海市农业科学院百合种质资源圃，圃地位于31°14′16.56″N，121°05′44.88″E，北亚热带季风气候区，年平均气温15.3～16.9℃，年降水量1104.4 mm。土壤有机质2.555左右，土壤pH 6.5左右。试验材料种植于草炭基质槽中，每平方米种植30～40个种球，田间管理和病虫草害防治方法保持一致。选择生长约90天的植株开展耐热性评价。

1.2 试验方法

试验于2019年7月30日进行，该段时间日平均气温为22～38℃，百合植株生长旺盛。于高温日（7月30日）37℃、13:00—14:30对生育期约90天的植株进行测定，采用连续激发式荧光仪（Pocket Plant Efficiency Analyzer，英国Hansatech公司）测定叶片（整株自上而下第5片叶）的叶绿素快相荧光动力学数，测定之前进行20 min暗处理，OJIP曲线由3000 μmol/(m2/s)红光诱导,测定时间为1 s,测定Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm、PIABS、DIo/CSo、φEo等7个指标，每个处理测定6个重复。

1.3 高温响应评价

采用模糊隶属函数法[11]，对37℃测定的不同的百合品种的叶绿素荧光参数进行分析，

并分别对每个指标求隶属函数值，计算见公式(1)～(3)。

公式中：Xi为各项指标的测定值，Xmax和Xmin分别为某项指标的最大值和最小值。如果某一指标性状与高温响应呈正相关，则选用式(1)，若呈负相关则用式(2)；将各个指标隶属值进行累加用式(3)。

1.4 数据处理与分析

采用Microsoft Office Excel 2010进行数据整理，R3.5.3软件进行相关性分析，采用SPSS17.0进行差异显著性分析。

2 试验结果

2.1 试验期间气温变化情况

2019年7—9月上海气温最高为37～38℃，试验选择高温日（7月30日）37℃、13:00—14:30开展。

2.2 不同百合品种叶绿素荧光参数对自然高温的响应情况

2.2.1Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm指标分析 由表1可知，在自然高温条件下，‘Tresor’的Fo最高，为704.25，‘Tiny Double You’的Fo最低，为370.2。Fm为最大荧光值，是光系统Ⅱ反应中心处于完全关闭时的荧光产量，反映了光合作用过程中的电子传递情况，Fm值越低，表明受高温伤害的程度越高，植株越不耐热。66份材料测定结果表明，‘Brindisi’的Fm值最低，为698.667，‘Armandale’的Fm值最高，为2454。Fv/Fo表示光系统Ⅱ的潜在活性，反映了PSⅡ的活性大小，Fv/Fo值越低表明PSⅡ反应中心受到伤害，耐热性越差。表1结果表明，‘Triumphator’的Fv/Fo值最小，为 0.3633，‘Tribal Kiss’的Fv/Fo值最大，为3.9907。Fv/Fm为最大光化学量子产量，表示PSⅡ反应中心的光能转换效率，Fv/Fm高意味PSⅡ中心原初光能的转化能力强，即对光能利用的潜力高[24]，由表2可知，‘Brindisi’的Fv/Fm值最小，为0.1993，‘Souvenir’的Fv/Fm值最大，为0.7775。

表1 不同百合品种Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm、PIABS、DIo/CSo、φEo的高温响应表现

续表1

续表1

续表1

表2 叶绿素荧光参数评价耐热性

2.2.2PIABS、DIo/CSo、φEo指标分析PIABS是以吸收光能为基础的光化学性能指数，由表1可知，66个品种中‘Brindisi’的PIABS值 最 小 ，为 0.0313，‘Sunny Martinique’的PIABS值最大，为2.2294；DIo/CSo主要反映PSⅡ反应中心以热能消耗能量的比率，由表1可知，‘Souvenir’的DIo/CSo值最小，为109.1131，‘Tresor’的DIo/CSo值最大，为467.7201；φEo主要表示用于电子传递的量子产额，由表1可知，66个品种中‘Nashville’的φEo值最小，为0.0622，‘Merlet’的φEo值最大，为0.4714。

2.3 荧光参数指标相关性分析

对66个品种的叶绿素荧光参数进行相关性分析。由图1可知，Fv/Fm与Fm、Fv/Fo、PIABS、DIo/CSo、φEo等指标相关性极显著，Fv/Fm与Fo相关性显著。其中Fv/Fm与Fm、Fv/Fo、PIABS、φEo呈极显著正相关，Fv/Fm与DIo/CSo呈极显著负相关；Fv/Fm与Fo呈显著负相关。

图1 不同品种叶绿素荧光指标参数的相关性

2.4 不同品种对自然高温响应的分析与评价

本研究发现Fv/Fm与检测的其他6种指标Fo、Fm、Fv/Fo、PIABS、DIo/CSo、φEo均显著相关，因此对上述指标进行了模糊隶属函数法分析，并进行综合指标AR值排序（图2、表2、表3）。据此，不同品种对自然高温的响应可分为5个级别，一级AR值为4.2859～5.4386，对高温不敏感 ，其中‘Souvenir’、‘Merlet’、‘Conca D'Or’排名前3；二级AR值为3.9371～4.2821，其中‘Sheer Blonde’、‘Pearl Frances’、‘Roselily Monica’排名前3；三级AR值为3.6439～3.8968，其中‘Roselily Samantha’、‘Tiny Bee’、‘Siberia’排名前3；四级AR值为 3.0458～3.6428，其 中‘Sunny Keys’、‘Fusion’、‘White Twinkle’排名前3；五级AR值为1.4066～3.0079，对高温敏感，其中‘Nashville’、‘Brindisi’、‘Tresor’对高温最敏感。

图2 不同叶绿素荧光参数分类数的误差函数

表3 不同分类数下66个品种的分类结果

3 讨论与结论

3.1 自然高温对百合叶绿素荧光参数的影响

高温会导致大多数园艺植物产量和质量的下降[12-13]，Gong等[14]报道高温会引起球根类植物营养生长停滞和种球退化等现象。此外，高温影响植物生理生化指标的改变，如植物细胞壁中过氧化物酶和二胺类氧化酶积累、细胞膜脂中不饱和脂肪酸和镶嵌蛋白含量的变化[15]、ABA/SA/BR/乙烯等植物激素的应答及核酸结构和蛋白质等的稳定性[16]，不同品种对高温的生理响应机制不同造成品种间耐热性的差异。不仅如此，高温还会引起植物光合作用能力下降，尤其当植物光合作用受到抑制，叶绿素光系统Ⅱ(PSⅡ)便会受影响[17]，在PSⅡ中，叶绿素荧光是一种无损伤检测植物受到逆境胁迫后光合系统响应情况的技术，可以准确反映光能吸收和传递过程，是研究植物光合生理及植物与逆境胁迫关系的理想指标[18]，国内外应用叶绿素荧光动力学开展植物抗逆性鉴定的研究越来越多，主要集中在高温胁迫[19]、冷胁迫[20-21]、干旱胁迫[22]等方面，可以在避免对植物造成伤害的情况下分析植物光合参数的变化，目前已被广泛应用于葡萄[23-24]、苹果[25]、水稻[26]、甘蔗[27]等园艺植物的抗性评价中，可以灵敏、快速、无损的完成抗性评价。本研究采用叶绿素荧光参数法测定百合品种在自然高温下的Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm、PIABS、DIo/CSo、φEo7个叶绿素荧光参数指标，反映了自然高温下百合叶片对高温胁迫的应激反应，并将66个百合品种对自然高温响应的敏感性进行等级划分，因此测定百合品种的7个主要叶绿素荧光参数，为从生理层面了解不同百合品种叶绿素荧光参数对高温的响应机制提供参考。

3.2 自然高温响应评价方法的科学性

前人关于高温胁迫的研究表明，高温胁迫一般会导致叶片的光合速率下降，Fv/Fm值下降[28]，Fv/Fm是反映PSⅡ光化学效率的敏感指标，一般植物叶片中叶绿素a的原初光化学效率较高，Fv/Fm值在0.80～0.85之间，值越低则表明植物受到的伤害越大，对热伤害越敏感。不同百合品种适宜生长温度一般低于28℃，不同品种略有差异，如‘亚洲百合’杂种系最适温度为白天维持在20℃～25℃，夜间8℃～10℃；‘东方百合’杂种系生根后最适温度为15℃～17℃，阳光充足时可以忍受20℃～22℃，甚至25℃。‘铁炮百合’生根后的最佳生长温度为14℃～16℃，阳光充足时可以忍受20℃～22℃[29]，本研究为提高叶绿素荧光特征参数测定的准确性，选取采用同样生育期的植株，在高温日条件下尽量短的时间快速完成大量样本的测定，以保证试验结果的准确性。研究结果表明自然高温环境下Fv/Fm值为0.20～0.78不等，同一品种较正常温度对照下测定的Fv/Fm值均出现不同程度的下降，说明高温胁迫会导致百合叶片的Fv/Fm值显著降低，抑制了百合的光能转化效率，这一结果与前人报道一致[19,24]，也说明自然高温37℃下测定百合叶绿素荧光指标具有参考性。

3.3 不同百合品种对自然高温响应鉴定结果及应用

鉴定结果表明不同百合组与杂交种、单重瓣类型在自然高温下的高温敏感性无明显相关性，如鉴定的18个亚洲百合和19个东方百合品种中5个等级均有，18个LA杂种系百合分别属于一、三、四、五级，7个OT杂种系百合分别属于一、三、五级；2个LO杂种系均为五级；1个LL系为四级。鉴定出‘Souvenir’、‘Merlet’、‘Conca D'Or’、‘Sunny Martinique’、‘Methone’等25个品种为高温不敏感的百合品种，‘Zambesi’、‘Triumphator’、‘Nashville’、‘Brindisi’、‘Tresor’等 19个品种为高温敏感的品种，这一结果为百合耐热性相关研究奠定基础。

3.4 结论

本研究以66份观赏百合种质资源为试验材料，开展叶绿素荧光参数对自然高温的响应研究，并采用模糊隶属函数法结合有序样本最优分割聚类法分析自然高温下不同品种的Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm、PIABS、DIo/CSo、φEo等7个指标，比较不同品种百合对自然高温逆境响应的敏感程度。结果表明，66份百合种质资源的Fv/Fm值在自然高温逆境下均受影响，采用隶属函数和有序样本最优分割聚类法将种质资源分为五个等级 ，‘Souvenir’、‘Merlet’、‘Conca D'Or’、‘Sunny Martinique’、‘Methone’等25个品种为一级，对高温逆境不敏感 ，适应性强 ；‘Zambesi’、‘Triumphator’、‘Nashville’、‘Brindisi’、‘Tresor’等 19 个品种为五级，对高温逆境较敏感，适应性差。本研究建立了适宜百合品种高温响应评价的方法，筛选对自然高温响应敏感与不敏感的百合品种，为进一步开展耐热相关机理研究和耐热品种选育提供参考。