D-丝氨酸与肾功能不全关系的研究进展

梁艳 金娟 龚建光 何强

丝氨酸是组成蛋白质的非必需氨基酸之一，L-丝氨酸（L-Serine,L-Ser）是其存在的天然形式，是葡萄糖通过一系列氧化和磷酸化反应合成的，参与蛋白质、核苷酸、脂肪酸、糖异生等代谢过程。D-丝氨酸（DSer）是L-Ser的对映异构体，内源性D-Ser是一种神经递质，在神经元发育和突触传递中发挥重要作用。对D-Ser研究最多的是在神经系统，它与精神分裂症、抑郁症、创伤后应激障碍、睡眠调节等[1-3]神经精神性疾病密切相关。有研究发现，高D-Ser水平与肾功能不全之间有密切的关系，它可能参与了肾脏损伤进程。本文就D-Ser与引起肾功能不全的关系研究进展作一综述。

1 D-Ser在体内的代谢特点

1.1 D-Ser的合成代谢 内源性D-Ser主要富集在大脑Ⅱ型星形胶质细胞中，是由L-Ser经过丝氨酸消旋酶（serine racemase,SR）消旋化形成的一种神经递质，是N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate,NMDA）谷氨酸受体的激动剂[4-6]。SR含有磷酸吡哆醛，对LSer有高度特异性[6-7]。大脑中合成的D-Ser经过体循环运输，是全身某些组织器官中D-Ser的主要来源[8]。另一方面，肠道菌群代谢也可产生D-Ser[9]。血浆中的L-Ser浓度是D-Ser的 20倍左右[10]。

1.2 D-Ser的分解代谢 D-Ser在血液中微量存在，主要由肾脏排泄。在体内由D-氨基酸氧化酶（D-amino acid oxidases,DAAO）进行氧化脱氨，生成羟基丙酮酸盐、过氧化氢和氨，最终能够减轻D-Ser在某些器官内蓄积所产生的毒性。DAAO在真菌、啮齿类动物和哺乳动物等真核生物中广泛分布，在人的嗜中性粒细胞、肾脏、大脑中都有表达，在肾脏中含量最高[11]。人体内的L-Ser通过一碳单位代谢参与三羧酸循环，是人体的重要营养物质，经肾小球滤过后，约99%被近端小管重吸收[12]，来维持内环境稳态。D-Ser与L-ser有很大的区别，在正常人中，D-Ser的排泄分数达到62.1%[13]，只有小部分在近端小管直部重吸收后，被肾小管上皮细胞内的DAAO降解[14]，因此，血浆D-Ser水平只达到体内D-Ser总量的3%[15]，说明肾脏能够以手性来选择性区分D型和L型氨基酸。

2 D-Ser与肾脏疾病

2.1 慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD） 中国成人的CKD患病率达到10.8%[16]，特别在农村地区，CKD的知晓率和控制率不容乐观，已成为我国的一个公共卫生问题。患者一旦进入终末期肾病（end stage renal disease,ESRD），只能靠肾脏替代治疗来维持生命，带来极大的痛苦和经济负担。目前，主要通过肾小球滤过率（glomerular filtration rate,GFR）和蛋白尿来对可疑患者进行筛查和管理[17]，因此，寻找新的生物标志物来早期诊断和预防CKD尤为关键。

血中D-氨基酸水平升高与肾功能不全之间的关系早有报道，当血肌酐升高时，血浆中D-Ser浓度可升高至20%以上，并与血肌酐和血尿素氮浓度呈正相关[18-20]。Kimura等[21]的一项队列研究中，使用二维-高效液相色谱技术对晚期CKD患者进行代谢组学分析，发现了血浆中的16种D-氨基酸，但是只有D-Ser和D-天冬酰胺（D-asparagine,D-Asn）水平的升高与GFR下降呈负相关，并与生存结局（肾脏替代治疗和全因死亡）密切相关，表明高水平D-Ser和D-Asn是CKD预后不良的生物标志物。最近，Hesaka等[13]用2D-HPLC技术检测患有不同肾脏基础病的CKD患者血浆中的D-Ser水平，发现其升高与菊粉清除率的下降呈显著负相关。D-Ser与肌酐不同，不受年龄、性别、肌肉量等的影响，它在人体内的分布比较稳定，这也是它可以用来反应肾功能受损的最大优势。众所周知，菊粉清除率是用来评估GFR的“金标准”，因此，D-Ser可能成为估计GFR的标志物，在对D-Ser的血浆水平和尿液排泄分数进行联合分析后发现，在非CKD的正常人中，D-Ser水平在一定范围内波动，而CKD患者由于GFR下降导致D-Ser尿液排泄显著降低，血液水平升高，因此能有效区分CKD患者与肾功能正常者，灵敏度和特异度可分别达到0.727和1.000。

2.2 急性肾损伤（acute kidney injury,AKI） AKI是指短期内肾小球功能急剧下降，可使ESRD的发病率增加13倍[22]，对于进展迅速的患者，尤其是ICU患者，死亡率极高[23]。Sasabe等[15]对缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury,IRI）诱导的AKI小鼠进行研究后发现，在正常小鼠尿液中，D-Ser含量是L-Ser含量的3倍；但在IRI小鼠的血液和随机尿样本中，D-Ser与L-Ser的比例（D-/L-Ser）发生了紊乱，肾衰竭患者体液中的的D-/L-Ser与IRI后发生严重肾功能不全的小鼠相似，证明了尿液中的D-/L-Ser可以更早的检测到肾脏损伤，比肾脏损伤分子-1（kidney injury molecule-1,KIM-1）和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL）更敏感，可以成为AKI的早期诊断标志物。Nakade等[9]进一步研究了D-Ser在肠-肾轴中的作用，IRI后，小鼠肠道中的微生物种群发生改变，并且粪便中的D-/L-Ser失衡，口服给予一定浓度D-Ser溶液后能够减轻肾小管损伤，并且一定浓度的D-Ser可以对缺氧后的肾小管细胞起到保护作用，促进增殖。这与其他学者的研究[12，14，17-18]中表现出的D-Ser与肾功能不全有关的结果有差别，可能与肾小管细胞对D-Ser浓度的敏感性有关[9]。

2.3 急进性肾小球肾炎（rapidly progressive glomerulonephritis,RPGN） Hesaka等[24]的一项病例报告中，对1例由抗中性粒细胞胞质抗体相关性肾炎和系统性红斑狼疮肾炎引起的RPGN患者病程中的D-Ser水平进行观察，在急性期，患者血浆中的D-Ser水平异常升高，尿液排泄分数为0%，在强化治疗过程中，该患者血浆和尿液中的D-Ser水平值逐渐恢复正常，与肌酐水平变化基本吻合。由此可见，体液中的D-Ser水平可以用来反映GFR的下降和恢复情况。该项病例研究真正将体内D-Ser水平的监测用于指导临床治疗，为D-Ser的临床应用奠定了基础。

2.4 其他继发性肾脏病 在一项前瞻性横断面研究中，Iwakawa等[25]对有高血压、糖尿病、血脂异常、吸烟等心血管事件和CKD危险因素的65例对象进行随访研究发现，用酶法检测的晨尿D-Ser水平与GFR呈正相关，与肾小管损伤标志物肝型脂肪酸结合蛋白（liver-type fatty acid-binding protein,L-FABP）和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-D-glucosaminidase,NAG）无相关性，并且在校正了低左心室射血分数和使用利尿剂等一系列危险因素后，尿低水平DSer仍是这些患者肾功能恶化的独立预测因子，灵敏度和特异度均为0.74。由此可见，尿液D-Ser水平检测由于标本留取方便和非侵入性的优点，可能成为具有心血管危险因素患者的肾脏事件预测标志物。

3 高水平D-Ser引起肾功能不全的可能机制

在GFR下降初期，肾脏通过代偿，增加尿液中DSer的排泄，来维持D-Ser在血液中的低浓度，随着GFR的进一步下降，D-Ser会在血液中蓄积[13]。而随着肾功能的恢复，肾脏同样通过增加D-Ser的尿液排泄来降低其血液水平[24]。综上所述，D-Ser在肾脏内存在一定的平衡机制。当D-Ser水平在体内发生紊乱时，会对肾功能产生不良影响，损伤肾小管[26-27]。

3.1 氧化应激损伤 D-Ser主要在近端小管直部被特异性重吸收，那里也是DAAO主要分布的区域，D-Ser可通过DAAO的代谢来损伤大鼠近端小管直部，出现氨基酸尿和蛋白尿[14]。Zhang等[28]证明了大鼠发生急性缺血性肾损伤后，肾脏的DAAO活性降低。同时，DAAO能够降低肾脏中谷胱甘肽活性[29]，使其对活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）的清除减少，再加上D-Ser代谢产物羟基丙酮酸盐和过氧化氢的累积，导致肾小管氧化损伤，出现坏死。然而，Orozco-Ibarra等[30]用D-Ser诱导大鼠产生肾功能损伤，检测肾脏中的血红素氧合酶-1、丙二醛、ROS等氧化应激标志物水平，结果显示并无改变，因此，他们认为D-Ser诱导肾小管损伤与氧化应激无关，至少在肾脏损伤早期不发挥作用，但是并没有否定谷胱甘肽的作用。这两项实验都是动物实验，均为研究D-Ser的肾脏损伤机制提供了很好的参考价值，仍需要在具体的肾病模型中进行大量研究。

3.2 丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-1（alanine-serine-cysteine-1,Asc-1）转运体参与 正常血液中的D-/L-Ser较低，这与近端小管对D-Ser和L-Ser的重吸收不平衡有关。发生肾损伤时，血液中的D-Ser浓度升高，表明近端小管对D-Ser重吸收增多，但肾脏的手性选择性具体机制未明。近端小管Asc-1转运体是一种中性氨基酸转运蛋白，主要表达于神经系统[31]、肾远端小管和集合管[32]。Suzuki等[33]用顺铂诱导小鼠近端小管特异性损伤后，血液中D-Ser浓度升高与Asc-1的mRNA表达水平上调呈正相关，同时用顺铂处理肾细胞系，细胞内D-/L-Ser升高，说明Asc-1提高了对D-Ser的转运能力，而对L-Ser亲和力较高的中性氨基酸转运蛋白的表达下调。

3.3 一般性调控阻遏蛋白激酶2（general control nonderepressible 2,GCN2）激活 细胞在面对体内外环境变化时，通过快速调节基因转录和翻译的产物水平来迅速恢复稳态，这就是综合应激反应（integrated stress response,ISR）。当发生肾损伤时，近端小管对L-Ser的重吸收减少，细胞内L-Ser水平降低，导致tRNA合成时不能氨基酰化，去酰基化tRNA水平升高，后者能结合并激活氨基酸传感器GCN2[34]，GCN2进一步磷酸化真核翻译起始因子2α，从而抑制蛋白质翻译，并激活活化转录因子4（activated transcription factor 4,ATF4）[35-36]，最后触发了ISR。ATF4能够激活细胞自噬[36]、衰老和凋亡[35]相关信号分子如CCAAT增强子结合蛋白（CCAAT enhancer binding protein,C/EBP）同源蛋白[25]等的表达，分泌促炎和促纤维化等细胞因子，加重CKD进展。此外，GCN2在真核细胞中广泛表达，其过度激活还与多种疾病有关，比如气道炎症[37]、肠炎[38]、肿瘤免疫抑制[39]、艾滋[40]等免疫系统相关疾病。有报道通过临床病例分析，发现GCN2过表达可能是乳头状肾细胞癌的预后不良标志物[41]。

3.4 N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDAR）介导 NMDAR主要分布在中枢神经系统，此外，在肾脏、心脏、骨、甲状旁腺[42]和胰腺[43]等组织器官中都有表达。NMDAR是一种阳离子通道受体，是由功能性亚单位NR1和调节性亚单位NR2A、NR2B、NR2C、NR2D或NR3A、NR3B组成的异源性四聚体[44]，对Ca2+具有高通透性，可引起与Ca2+内流有关的膜电位事件。

D-Ser是近年来新发现的NMDAR的调节剂[4]，可正向调节NMDAR下游信号通路。D-Ser能够与胰腺β细胞上的NMDAR作用，抑制胰岛素分泌，引起血糖升高[43]。糖尿病肾病（diabetic kidney disease,DKD）是糖尿病最严重的并发症之一，在美国，40%的DKD最终发展成ESRD[45]。NMDAR在肾中广泛表达，足细胞NMDAR长时间激活会引起氧化应激、凋亡等损伤。已有研究证明，NMDAR拮抗剂可阻止糖尿病引起的肾功能损伤[46-47]。同时，给大鼠腹腔注射一定剂量的D-Ser后，可通过过度激活NMDAR来激活下游的Ca/PKC/NOX信号通路，促进氧化应激对肾小管的损伤，而阻断NMDAR的表达可以减少超氧化物的产生，减轻 D-Ser引起的 AKI[27]。

4 小结和展望

近几年对氨基酸对映体的研究丰富了氨基酸代谢组学在疾病中的研究和应用，尤其是D-Ser在肾脏疾病中的研究。D-Ser可能成为新的肾脏损伤标志物。在CKD预后预测、AKI早期筛查和监测疾病活动性等方面都表现出很高的灵敏度和特异度。同时，LSer支持疗法和阻断ISR下游信号通路可以改善D-Ser对人肾皮质近曲小管上皮细胞的增殖抑制[35]、α-氨基异丁酸通过抑制大鼠近端小管对D-Ser的摄取来保护肾小管[29]及肠道微生物产生的D-Ser可促进肾小管细胞增殖[9]等研究的发现，都为肾功能不全的治疗提供了新策略。但是目前，D-Ser的研究多在动物模型中进行，临床样本研究数量较少，引起肾功能不全的机制尚未明确，再加上高效液相色谱定量测量的条件限制，今后还需要更深入的研究来推进D-Ser检测的临床应用，使之联合其他监测指标来实现对不同肾病类型和肾损伤程度的患者进行精准化治疗，提高早期肾功能不全诊断阳性率，实现早期治疗，改善预后。