尿液蛋白质组学质谱分析用于原发性肾病综合征诊断的研究进展

王彬淇 何强

肾病综合征（nephrotic syndrome，NS）是以大量蛋白尿、低白蛋白血症、高脂血症和水肿为特征的一组临床综合征。原发性肾病综合征（primary nephrotic syndrome,PNS）在肾活检病理数据库中约占40%，是导致终末期肾脏病的重要原因[1]。临床上对PNS进行早期诊断及早期治疗有重要意义。蛋白质组学技术具有高灵敏度、高准确度的特点，既可发现相关疾病的病因标志物，又可探讨其潜在的发病机制[2]。近年来，尿液蛋白质组学质谱分析在肾脏病诊治中的应用研究逐渐增多，本文就该技术用于PNS诊断的研究进展作一综述。

1 NS

NS是常见的肾小球疾病，其分类根据病因分为原发性和继发性，前者的诊断主要依靠排除糖尿病肾病、狼疮性肾炎、肾淀粉样变性、药物、肿瘤等继发性因素。PNS常见的病理类型有微小病变肾病（minimal-change disease,MCD）、膜性肾病（membranous nephropathy,MN）、局灶节段性肾小球硬化（focal segmental glomerulosclerosis,FSGS）、系膜增生性肾小球肾炎（mesangial proliferative glomerulonephritis,MsPGN）、膜增生性肾小球肾炎（membranoproliferative glomerulonephritis,MPGN）[3]。不同类型的PNS临床症状多有相似，且有概率从轻症快速进展为终末期肾脏病。但患者临床表现的严重程度并不总与肾活检中肾脏损害的严重程度呈正相关[4]。大多数患者仅接受单次肾活检以确定肾脏疾病的病理类型，在散发病例中，重复活检可以评估疗效和预后。然而，肾病活动消退的评估对治疗的动态评价至关重要。

2 蛋白质组学与质谱分析方法

“蛋白质组”这一概念于1994年由澳大利亚学者首次提出，意指基因组所表达的全部蛋白质[5]。蛋白质组学研究是不可预知的，它以客观的方式来揭示分析物与疾病之间的联系，帮助我们更广泛地去探索疾病。随着蛋白质组检测仪器、技术及生物信息学分析软件的飞速发展，蛋白质组学的研究进入黄金时代。其中质谱分析方法具有较高复用能力，并且已经可以提供大多数目前已知的不同肾病中尿肽和蛋白质含量的信息，以及各种疾病的潜在生物标志物[6]。与传统检测方法相比，质谱分析具有高准确度、高灵敏度、线性范围宽及高通量等优点。临床上，质谱分析技术可应用于生化检验、免疫学检验、微生物检验及分子生物诊断等多个方面[7]。目前已有研究表明，质谱分析方法诊断淀粉样变肾病相较常规肾活检免疫荧光标记技术而言，有更高的灵敏度和特异度，并有望成为淀粉样变肾病分型的新“金标准”[8]。

目前，最常用的质谱分析方法包括基质辅助激光解吸飞行时间质谱、毛细管电泳-质谱联用和液相色谱-质谱联用。同位素标记相对和绝对定量技术及串联质谱标签技术有助于在常见的蛋白质和多肽数量变化显著时识别它们。一般来说，所列的非靶向质谱方法最适合初步探索潜在生物标志物，而靶向质谱和免疫分析可用于进一步验证。

3 尿液蛋白质组学

血液、组织液、尿液等是研究诊断性生物学标志物的最佳临床生物样本。相较其他样本蛋白质组学分析，尿液蛋白质组学分析有许多优点。首先，尿液蛋白质组不是很复杂，其中肾脏来源的蛋白质和多肽高达70%，而肾损伤标志物只占高度多样化的血液蛋白质组中的一小部分。其次，尿液中蛋白质生物标志物浓度比血液中更易正常化，例如肌酐[9]。第三，尿液的收集简单且无创。最后，尿液样本在-20℃的温度下能保持稳定，即使储存多年也适合进行蛋白质组学分析[10]。尿液的上述优点使其成为寻找各种病理蛋白质标志物的热门课题。这些病理包括肾脏、泌尿生殖系统以及与蛋白尿相关的病理，如肾脏疾病[11]、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌[12]、糖尿病肾病[13]及先兆子痫[14]。尿蛋白标志物也被用于描述结肠癌、肺癌[15]、胆管癌[16]、心血管疾病[17]、自身免疫性疾病[18]及传染病[19]。尿液蛋白质组可涵盖最多的肾脏病理相关信息，并能提供不同肾脏疾病的指纹图谱[6,20-21]。然而目前国内外尿液蛋白质组学研究成果的临床转化仍处于早期阶段，其中一个重要的限制因素就是经济成本。

4 常见PNS的尿液蛋白质组学质谱分析研究进展

4.1 MCD与FSGS MCD和FSGS是原发性足细胞损伤性疾病（原发性足细胞病），主要表现为大量蛋白尿和NS[22]。然而，对FSGS早期肾脏活检的形态学研究可能会遗漏单个肾小球的节段性硬化，并可能误诊为MCD[23]。因此一些研究旨在确定这两种肾病之间的蛋白质组学差异。特别是在FSGS中，钙网膜蛋白和尿泛素核糖体结合蛋白52水平较高[24-25]，而39S核糖体蛋白L17在MCD中含量较高[24]。在FSGS的塌陷变异型（以肾小球塌陷和肾功能快速丧失为特征）病例中，组织蛋白酶B、组织蛋白酶C和膜联蛋白A3的水平明显高于MCD、MN和其他FSGS变异型患者[26]。

一些仅针对FSGS的潜在标志物包括类钙黏蛋白26、RNaseA 家族 1、DIS3样核酸外切酶 1[27]、基质重塑蛋白 8（matrix-remodeling protein 8,MXRA8）[28]、CD59、胰岛素样生长因子结合蛋白7和ROBO4[29]，以及多聚免疫球蛋白受体和高尔基体相关嗅觉信号调节因子[30]或完全缺乏的二肽酶1[29]。而仅在MCD患者中发现有CD14水平的升高[27]，这是在其他肾病中都未发现的。同时，转铁蛋白和富组蛋白-3的升高可能将FSGS和MCD与其他类型的肾脏疾病区分开来[24]。在已发现的潜在标志物中，核糖核酸酶2的过度表达和结合珠蛋白的低表达可能提示FSGS的最差预后，而载脂蛋白A1和MXRA8在类固醇敏感和类固醇耐药的FSGS之间表现出显著变化[28]。

尿液中大多数上述蛋白的存在及其水平的升高可能反映了足细胞与肾小球分离过程中大量细胞死亡和细胞内容物释放。这些结果也可能提示免疫、炎症和细胞凋亡在FSGS发展过程中的特殊作用。细胞增殖、分化和死亡可能与MCD的发展有关[31]。利用阿霉素FSGS大鼠模型进行的动态研究显示，Afamin和铜蓝蛋白逐渐增加，而钙黏蛋白-2和聚集蛋白聚糖核心蛋白逐渐减少，提示胎球蛋白B、α1微球蛋白和α2-HS-糖蛋白水平的降低可能有望成为早期发现FSGS的标志物[32]。其他有希望的标志物包括CD44、MXRA8、组织蛋白酶和载脂蛋白A1。CD44反映了壁层上皮细胞的激活，从而引发了肾小球硬化。MXRA8、组织蛋白酶参与纤维化累积和疾病进展。载脂蛋白A1反映氧化应激与高脂血症有关，是FSGS发生、发展的致病因素之一。

4.2 MN MN是成人PN的主要病因。MN的主要机制是抗磷脂酶A2受体（phospholipase A2 receptor,PLA2R）抗体对足细胞的自身免疫性损伤，导致大量蛋白尿。目前对该病的诊断和治疗主要基于PLA2R抗体滴度测定。在PLA2R抗体阴性的特发性MN中有望找到其他标志物。

区分MN与其他肾病的特异性尿蛋白标志物包括锌指蛋白ZFPM2、E1A结合蛋白、微管相关蛋白tau、AP3D1蛋白的水平降低[30]。以及甲状腺素结合球蛋白[27]、溶酶体膜蛋白-2（lysosome membrane protein-2,LIMP-2）[33]、纤溶酶原[30]、LDB3、PDLI5[22]及 Afamin[34-35]水平升高。对APLA2R阳性的MN和APLA2R阴性的MN患者以及健康个体的样本进行比较，发现阳性MN组的α1-抗胰蛋白酶和Afamin水平显著升高[36]。

尿视黄醇结合蛋白4和SH3结构域富谷氨酸富集样蛋白3相结合可以区分MCD和糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）。类似地，尿Afamin和血浆C3的比值相结合可以区分MN和DN[34]。

一般来说，在MN中发现的标志物在补体激活和免疫反应、细胞黏附、受体介导的内吞作用、血小板脱颗粒和凝血级联等经典途径中发挥作用[35]。LIMP-2在肾组织炎症免疫反应调节中起着关键作用[33]，反映了免疫细胞的组织浸润。LIMP-2也可能有助于确定疾病活动性。LDB3和PDLI5蛋白在足细胞细胞骨架的修饰中发挥作用，从而导致蛋白尿。Afamin的升高与特发性MN有关，它的重要性已在多项研究中得到证实，是最有希望的特异性MN标志物。

4.3 MsPGN MsPGN是我国原发性肾小球疾病中最常见的病理类型，约占PNS的30%。主要病理特征为弥漫性肾小球系膜细胞增生及不同程度系膜基质增多。目前一般认为本病是由于免疫紊乱造成的肾脏炎症损伤，据其免疫病理可将MsPGN分为IgA及非IgA两大类，其中IgA为最常见的类型[37]。在欧洲，IgA肾病的发生率在肾小球疾病的肾活检中达19%到51%[38-40]。

目前已发现大约40种尿蛋白标志物可区分IgA肾病，其中IgA肾病的特异性标志物超过20种。在本团队的前期研究中，对50例IgA肾病患者及50名健康人的尿液进行蛋白质组学分析，发现Eph受体A4和profilin-2蛋白在IgA肾病患者的尿液样本中显著上调，而分泌跨膜蛋白1和肿瘤相关钙信号转导蛋白2则显著下降[41]。在IgA肾病患者的肾小球（活检样本）中，C9、免疫球蛋白k链C结构域和3种细胞骨架角蛋白（I型细胞骨架角蛋白10、Ⅱ型细胞骨架角蛋白1、Ⅱ型细胞骨架角蛋白5）的水平与肿瘤患者肾组织间区同步变化[42]。在肾功能稳定及少量蛋白尿的IgA肾病中发现了30种尿蛋白和4个潜在标志物（细胞间黏附分子1、金属蛋白酶抑制剂1、抗凝血酶Ⅲ、脂联素）的水平改变。一项更大规模的多中心研究表明，进展性IgA肾病患者尿液中胶原片段的数量减少（尤其是Ⅰ型胶原）可能是由于肾脏纤维化中胶原降解减少和胶原酶的抑制[43]。

其他潜在的IgA肾病特异性标志物包括脂联素[44]、α2-巨球蛋白、C4a、凝血酶原、抗凝血酶Ⅲ[44]、α1-B-糖蛋白[45]、糖蛋白2、表皮生长因子、CMRF35样分子、原钙黏蛋白、子宫球蛋白、二肽基肽酶Ⅳ、非霍奇金淋巴瘤重复蛋白3和CD84[46]水平增加，以及fibulin-5、YIPF3、SAP[47]、氨基肽酶 N[48]及 endorepellin 的 LG3片段水平降低[45]。最后一个是肾小球滤过率较低的较重IgA肾病患者中唯一降低的蛋白[45]。同时，高LG3水平可抑制血管生成，并导致一些IgA肾病患者的肾功能丧失[45]。虽然关于VASN水平变化的数据不一致[46,48]，但它也可以被认为是特异性的IgA肾病标志物。特别值得注意的是，抗凝血酶Ⅲ是唯一在两项独立研究中证实的特异性IgA肾病标志物。

5 小结

目前，肾活检组织病理仍是诊断肾脏疾病的金标准，但其具有一定的创伤性，且临床应用受限。而蛋白质组学质谱分析在肾脏疾病的非侵入性诊断、阐明疾病进展的主要发病机制、确定抑制疾病进展的作用靶点等方面具有巨大潜力。其主要特点是，尿液中检测到的许多标志物都是蛋白质从血液中渗透出来的结果。与肾活检相比，尿液蛋白质组学质谱分析更安全可靠且能动态观察疾病的发展进程及预后评估。同时尿液蛋白质组学谱能提供检查时肾脏主要病理过程的有价值信息。

PNS患者尿蛋白质组学质谱分析的最重要目标之一是确定疾病特异性生物标志物或其组合。第一次提取的蛋白质最值得关注，因为它们也许能反映疾病发展中最重要的发病阶段。例如，CD44，一个被激活的壁上皮细胞标志物，可能反映了MN[27]或IgA肾病[6]肾小球硬化的过程，但同时也可能是区分FSGS和MCD[29]的一个重要特征。

此外，指定疗法后蛋白质组图谱的动态变化可能有助于确认药物的选择是否正确，并有助于达到预期的结果。然而，影响蛋白质组组成的因素很多，包括采集条件和采集方式（早上、每天、几天内的变化情况等）、体力活动、营养情况、泌尿系统的解剖特征（如缺少一个肾脏等）以及性别和年龄[49-50]。在比较不同研究的结果时，所有这些因素都应该被考虑在内。由于国内外对肾脏疾病蛋白质组学的研究仍是单中心研究较多，样本数量有限，因此，目前仍没有可靠的肾脏疾病特异性生物标志物可在不同的研究中准确再现。一般来说，将不同研究中概述的特定肾病标志物相结合，可以促进在多阶段前瞻性验证后更好地创建高特异性区分模型以供临床使用[51]。