抗菌蓝光在治疗细菌感染性疾病中应用的研究进展

王瑞凤, 刘旭旭, 李 芳, 刘 敏

（吉林大学口腔医院牙周科，吉林 长春 130021）

细菌感染是致病菌或条件致病菌侵入宿主体内，产生毒素和其他代谢产物所引起的局部或全身性感染［1］。细菌感染性疾病可引起感染性休克、败血症和脓毒血症等并发症，严重威胁患者的生命。目前细菌感染性疾病的主要治疗手段是使用抗生素，但可引起细菌耐药性增加。因此，开发一种安全高效且不易引起细菌耐药性的抗菌方法迫在眉睫。抗菌蓝光（antimicrobial blue light，aBL） 疗法是一种基于光的新型抗菌方法，近些年在细菌感染性疾病中广泛应用。GWYNNE 等［2］证明：波长400～470 nm 的aBL 即使无外源性光敏剂的参与也能发挥优异的抗菌作用。aBL 不易使细菌产生抗性，还可以直达感染病灶，且光的辐射参数易于控制，拥有更好的安全性，对于治疗细菌感染性疾病具有极大的优势和前景。近些年许多学者在aBL 对细菌的灭活机制、灭活效果（包括浮游细菌、菌斑生物膜和体内外实验） 及aBL 在细菌感染性疾病中的临床应用研究等方面进行了大量研究，但目前相关的综述报道较少，现结合近年来国内外相关研究进展，从aBL 对细菌感染性疾病的作用机制和在体内外实验的作用效果及临床应用现状等方面进行综述，以期为aBL 成功应用于细菌感染性疾病的治疗提供参考。

1 aBL 对细菌的杀伤机制

目前普遍公认的aBL 对细菌的杀伤机制假说［3-4］是aBL （尤其是波长为400～470 nm） 激活细菌的内源性光敏剂（内源性卟啉和黄素等），该内源性的光敏剂从基态被激发到高能三重态，三重态光敏剂与周围的分子发生相互作用，随后通过2 种途径产生具有高细胞毒性的活性氧（reactive oxygen species，ROS）。ROS 与大量微生物大分子快速反应，破坏细胞膜、脂质和遗传物质等靶点，最终导致细菌死亡［5-7］。

1.1 细菌内源性光敏剂

研究［8-12］证实：具有蓝光敏感性的细菌存在内源性光敏剂，该类细菌在aBL 照射下，其内源性光敏剂被激发产生ROS 导致细菌死亡。

许多学者利用光谱和超高效液相色谱分析法证明了细菌中内源性光敏剂的存在并鉴定了光敏剂的种类，细菌中存在的内源性卟啉主要是共卟啉、原卟啉Ⅸ（protoporphyrin Ⅸ，PpⅨ）、尿卟啉和粪卟啉，通过aBL 的照射可以产生ROS，进而对细菌产生杀伤作用。LIU 等［13］证明：PpⅨ和粪卟啉是卡他莫拉氏菌中最丰富的2 种内源性卟啉。实验研究［14］表明：痤疮丙酸杆菌中的内源性卟啉主要也是PpⅨ和粪卟啉，PpⅨ和粪卟啉被aBL 激活后，从基态转移到三重态，产生的ROS 对细菌产生氧化损伤，最终导致其死亡。KARNER 等［15］和WANG 等［16］分别对幽门螺杆菌和淋球菌提取物进行光谱和质谱分析，结果表明：其内源性光敏剂为卟啉和黄素。PLASKII 等［4］在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中同样提取到了卟啉和黄素，其卟啉组分主要为共卟啉和尿卟啉。另外，口腔中的某些牙周致病菌（牙龈卟啉单胞菌［11，17］和普氏菌［11］及伴放线聚集杆菌［12］） 也含有对蓝光敏感的内源性光敏剂。

近年来还有学者利用基因敲除突变体的方法来验证aBL 的抗菌作用机制与内源性卟啉的存在有密切关联。GRINHOLC 等［18］比较了具有内源性卟啉的野生型金黄色葡萄球菌和内源性卟啉基因敲除的突变型金黄色葡萄球菌（缺乏产生内源性卟啉的能力） 在aBL 下的杀菌效果，结果显示：野生型金黄色葡萄球菌于aBL （波长405 nm） 照射下活力明显降低，而突变型菌株在相同波长和能量密度的aBL 照射下活力无改变。该结果支持了aBL 的抗菌作用是由于细菌中存在的内源性卟啉被光激发，从而产生抑菌效果的假说。另有研究［19-20］显示：铜绿假单胞菌基因组敲除突变株（PA3977） 由于缺乏卟啉合成途径中的转氨酶（缺乏产生内源性卟啉的能力），因此对aBL 的照射不敏感，而野生型菌株对aBL 的照射极其敏感。RUPEL 等［21］为进一步验证此假设，在PA3977 突变株菌体内添加1 个额外的携带PA3977 片段和核糖体结合位点的完整序列质粒，结果显示：额外添加质粒的突变株在aBL照射下恢复敏感，证实卟啉合成途径中的转氨酶和卟啉的合成在细菌对aBL 的反应中起关键作用。

最近的研究［22］表明： 细菌的体外培养条件（培养时间、传代时间和培养基） 对内源性卟啉的生成（卟啉量和卟啉种类） 有很大影响。在上述相关研究中，只有部分研究对内源性光敏剂进行了定量分析，而且不同的研究衡量内源性光敏剂含量的单位不同［22-23］，因此目前的研究数据仅支持细菌内源性光敏剂的存在是aBL 抗菌的必要因素，aBL 的疗效与细菌中内源性光敏剂含量之间的关系有待进一步研究。另外，不同类型的内源性光敏剂与aBL的抗菌效果是否存在联系也需更深入的研究。

1.2 ROS 产生途径

aBL 激发光敏剂后通过2 种途径产生ROS［2］。①途径Ⅰ：将电子从有机底物分子转移到光敏剂，产生不稳定的阳离子有机底物和阴离子光敏剂，在有氧环境中不稳定的离子可以进一步与有机底物发生反应生成ROS，包括超氧化物、过氧化氢和羟基自由基；②途径Ⅱ：利用分子氧通过直接能量转移产生具有高反应活性的单线态氧（1O2）。由于氧和有机底物会共同竞争与光敏剂的反应，因此途径Ⅰ有利于高有机底物和低氧浓度的情况，更常见的途径Ⅱ有利于高氧浓度的情况。

aBL 对细菌的杀伤过程主要通过途径Ⅱ产生1O2引起氧化应激对细菌产生毒性。CIEPLIK 等［12］证明： 在波长460 nm 的aBL 激发下，裂解的伴放线聚集杆菌通过途径Ⅱ产生了1O2。有学者［24］用电子自旋共振方法证实：部分细菌在aBL 照射下不仅产生了1O2，还产生了羟自由基和超氧阴离子。研究［25］显示：可以清除1O2的叠氮化钠（NaN3） 仅部分抑制了波长405 nm 处aBL 对淋球菌的杀伤作用，表明除1O2外还有其他物质（超氧阴离子、过氧化氢和羟基自由基等） 通过途径Ⅰ参与了ROS 的形成。以上研究［11，24-25］结果显示：aBL 杀伤细菌主要通过途径Ⅱ产生1O2，小部分杀伤作用是由途径Ⅰ产生的羟自由基和超氧阴离子等。但HOPE等［26］的研究与上述结论不同，波长405 nm的aBL在厌氧条件下可使牙龈卟啉单胞菌悬液产生致死性光敏作用，表明aBL对牙龈卟啉单胞菌产生的杀伤作用主要由途径Ⅰ产生。造成上述结论不同的原因之一可能是还原了厌氧环境，导致细菌培养环境处于低氧浓度状态，从而更有利于途径Ⅰ的发生；另外可能是由于选择的牙龈卟啉单胞菌是一种含有较多内源性光敏剂的革兰阴性厌氧菌，革兰阴性细菌容易受到羟基自由基的影响，羟基自由基更容易在低氧条件下产生。由此可见，在aBL抗菌的过程中途径Ⅰ和途径Ⅱ之间存在的竞争可能取决于反应发生的氧浓度等微环境［27］。

1.3 aBL作用于细菌的靶点

aBL具有多靶点破坏的特点，与只有单一靶点的药物不同，其产生的ROS可以作用于细菌的多个生物分子，如细菌细胞膜、脂质和遗传物质等，对细菌产生致死性杀伤作用。

在aBL抗菌过程中，ROS对微生物细胞膜的破坏是导致细菌死亡的一个重要原因。对于任何生物细胞来说，膜电位具有重要的生理意义［28］，是参与ATP生成的质子动力的组成部分，与细菌自溶、葡萄糖转运、趋化和在低pH值条件下的存活有关［29］。因此，细胞膜内外电势降低会导致细菌生理过程的失常，最终导致死亡。BIENER等［30］研究表明：aBL的照射首先导致细胞膜完整性的改变，随后是细胞膜内外电势的降低和重要细胞功能的改变。KARNER等［15］研究显示：aBL能引起幽门螺旋杆菌表面形态改变，表明细胞膜是aBL的主要靶点之一，随后发生细胞内容物的泄漏、膜运输系统失调和酶失活，最终导致细菌死亡。KIM等［31］用aBL对沙门氏菌进行照射，观察到其膜电位和细胞膜完整性发生变化，外排泵活性丧失，葡萄糖摄取系统受损。aBL对于细菌细胞膜的破坏不仅是膜电位和细胞膜完整性的改变，细胞膜上的脂质 也是ROS识别的靶点。WU等［32］对耐甲氧 西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）的脂肪酸含量进行了监测，结果发现：3种不饱和脂肪酸（C16∶1、C20∶1和C20∶4）的相对含量在aBL照射下降低，表明细胞膜上不饱和脂肪酸成分的改变是细胞膜破坏的重要因素。

ROS对微生物遗传物质的改变是aBL抗菌过程中导致细菌死亡的另一个重要原因。KIM等［31］用波长405 nm的aBL对沙门氏菌进行辐照，不仅证明了细菌细胞膜受损，同时发现细菌DNA氧化水平升高、染色体和核糖体结构紊乱。CHU等［33］对aBL灭活阪崎肠杆菌的转录反应研究显示：编码抗氧化剂的基因表达上调。细菌对ROS引起的氧化反应所涉及的基因表达通常是在调节因子的控制下进行的，调节因子可以直接感知特定的ROS水平，并激活或抑制其靶基因的转录，影响生物膜的形成和宿主免疫反应的逃避，还可通过特定蛋白质的直接调节使细菌产生耐药性［34］。

aBL疗法是对细菌多靶点的破坏，与单一靶点的药物治疗比较，细菌更不易产生抗性。aBL在对细菌灭活过程中是否存在其他的靶点以及靶点之间是否有主次之分，仍需进一步研究。

2 aBL对细菌的杀伤效果

2.1体外实验的抗菌效果

2010年美国微生物学会指出：每种抗菌新方法都必须证明菌落形成单位（colony forming unit，CFU）降低3 log10的作用效果才能使用“抗菌”一词。体外实验［35-36］表明：波长400～470 nm的aBL具有抗菌作用，能够有效灭活一系列革兰阳性和革兰阴性细菌，包括浮游态和生物膜状态的细菌。该灭活效果可能受细菌种类和aBL的波长及发射形式等因素的影响。

2.1.1 aBL对浮游细菌的作用效果不同发射波长的aBL对细菌的杀伤效果不同。aBL对于细菌最有效的灭活波长为405 nm，是由于卟啉的紫外可见吸收光谱在此处表现出最大的峰。WANG等［16］比较了悬浮液中淋球菌对405和470 nm波长aBL的敏感性，结果显示：在波长405 nm处经aBL（27 J·cm－2）照 射 可 使CFU减 少 约3.12 log10，而在 波 长470 nm处 经aBL（234 J·cm－2）照 射 可 使CFU减 少 约3.70 log10，与 波 长405 nm的aBL比较，淋球菌若暴露于波长470 nm的aBL，则需要更高的能量辐射才能达到相同的杀菌效果。不同发射形式aBL对细菌杀伤效果也不同。研究［37］显示：在抗菌方面，脉冲蓝光比一般的连续波蓝光强40～100倍，脉冲450 nm蓝光比连续波蓝光对痤疮丙酸杆菌的抑制作用更强。该课题组［38］后续研究证明：在体外超低脉冲蓝光可100%灭活MRSA和痤疮丙酸杆菌。

HAMBLIN等［39］研 究 表 明：aBL（405 nm，20 J·cm－2） 照射后幽门螺旋杆菌灭活率达到99%；然而对于铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和大肠杆菌，通常需要超过50 J·cm－2的aBL 照射才能达到有效作用［40］。LIU 等［13］将可引起儿童中耳炎的卡他莫拉菌置于aBL （405 nm，216 J·cm－2） 下照射，悬浮液中CFU 减少了4 log10。有证据［41］显示：细菌中共卟啉的含量越高，细菌的灭活程度就越高。因此不同种类细菌对aBL 不同敏感性的表现可能是由于细菌中共卟啉含量不同而导致，但目前该证据还不充分，需要更加深入的研究来证实。

2.1.2 aBL 对菌斑生物膜的作用效果 目前对aBL 的绝大多数研究均基于浮游态细菌，该类细菌均匀地分散在液体介质中，但在自然界中大多数细菌聚集在生物膜中。生物膜是嵌入在自产聚合物基质中的细菌复合体，从扁平的薄层到复杂的蘑菇状构造不等［42］。与浮游细菌比较，生物膜中的微生物对传统抗生素和宿主防御更有耐受性，包括对抗菌药物、免疫细胞、化学物质和环境压力有更强的抵抗力［43］。由此可见，aBL 作用于生物膜的研究对于指导临床治疗细菌感染性疾病具有重要意义。

aBL 可以有效抑制菌斑生物膜的形成，其作用效果与生物膜成熟度有关。HALSTEAD 等［44］研究了aBL 对鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、嗜麦芽窄养单胞菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌和脑膜脓毒性黄杆菌各自构成的单菌生物膜的影响，结果显示：aBL照射后上述单菌生物膜的生存力降低了34.6%～96.4%。另一项研究［45］显示：鲍曼不动杆菌培养72 h 形成的生物膜比培养24 h 形成的生物膜对aBL的抵抗力强，随着时间的延长，生物膜逐渐成熟，结构复杂，导致其不易被灭活。研究［35］表明：96 孔细胞培养板上的单菌和多菌生物膜对aBL 高度敏感，但当生物膜在美国疾病控制与预防中心（United States Centers for Disease Control and Prevention，CDC） 生物膜反应器中生长时，对aBL 表现出较高的耐受性，该结果可能是因为CDC 生物膜反应器中获得的细菌生物膜厚度增加，因此相同条件的aBL 不足以灭活较厚的细菌生物膜。

aBL 对浮游细菌灭活效果最好，菌斑生物膜越成熟，其敏感性越差，单菌生物膜较多菌生物膜更易被aBL 灭活。因此对于菌斑生物膜需要加大能量剂量才能达到较为理想的灭菌效果。目前对于多菌生物膜的研究还相对较少，但临床上的细菌感染往往是多种细菌的联合感染，因此不断优化aBL 的作用条件，以使其对多菌生物膜具有更好的灭活效果更具有临床意义。

2.2 体内实验的抗菌效果

aBL 的抗菌效果在体内可能会受多种因素影响，如体内条件下的宿主防御机制可能与aBL 起协同或拮抗作用。另外，在体内和体外条件下，微环境也可能有很大不同，因此可能会影响内源性光敏的合成，从而影响aBL 的疗效。为了验证aBL 作用下的抗菌疗法是一种优于传统抗生素治疗的方法，aBL 的抗生物膜和抗病原性效果必须通过实验动物体内细菌感染模型的建立和治疗来证实。

RUPEL 等［21］建立了铜绿假单胞菌感染的小鼠皮肤伤口模型，与未进行aBL 照射的对照组比较，aBL 照射的实验组小鼠皮肤创面的细菌数量明显减少；此外，感染48 h 后，对照组小鼠皮肤各层均有明显的炎性细胞浸润，且均可检测到表皮和真皮的脱落，而实验组小鼠只表现出轻微的炎症或无炎症，并保留了正常的皮肤结构。ZHU 等［46］建立了铜绿假单胞菌感染的小鼠角膜炎模型，结果表明：单次暴露于波长415 nm 的aBL 能迅速而明显地降低细菌数量，但接种铜绿假单胞菌24 h 后照射比接种6 h 后照射，细菌对aBL 的敏感性降低，其原因可能是接种24 h 后，细菌主要以生物膜的形式存在，此时感染已经完全建立。WANG 等［47］建立了一种可生物发光的鲍曼不动杆菌菌株感染的小鼠皮肤烧伤模型，该发光菌株能无创地实时监测小鼠的感染程度，结果显示：小鼠在aBL 照射后，几乎看不到细菌发光图像，证明了aBL 在感染鲍曼不动杆菌的小鼠中成功地灭活了细菌。

由此可见，aBL 能明显降低实验动物感染部位的细菌存活率，有效实现活体组织的细菌杀伤，说明aBL 对感染性疾病有很好的治疗效果。值得注意的是，活体组织与体外介质的光学性质有很大的不同，会影响体内的光分布，aBL 在组织中的衰减较大，因此与体外抗菌比较体内抗菌需要更高配置的光条件。

3 aBL 在细菌感染性疾病中的临床应用

目前aBL 在细菌感染性疾病中的临床应用较少，大部分的研究还处于临床试验阶段。近年来有学者［48］比较了水杨酸脱皮和aBL 疗法治疗青少年寻常痤疮的疗效，结果显示：2 组患者的丘疹和脓疱均减少，但aBL 组患者脓疱数量明显减少。还有研究［49］显示：aBL 可以与红光联合应用，具有更好的抗炎和促进伤口愈合的能力，且拥有更高的安全性。牙菌斑是引起牙周炎的始动因子，SOUKOS 等［50］研究了aBL 对人体内牙菌斑的杀伤效果，受试者在光照前3 d 和光照期间不刷牙，经aBL 照射口腔一侧后牙颊面后，患者口内光照侧的牙龈卟啉单胞菌和中间普氏菌比例分别减少了25% 和56%，而非光照侧无明显变化，此外光照侧牙龈红肿降低了6%，而非光照侧牙龈红肿增加了3%，说明aBL 可能同时具有抗菌和抗炎活性。LEWIS 等［51］将aBL 应用于阑尾炎患者的术后护理，阑尾炎患者被随机分为2 组，分别接受术后标准护理和标准护理加aBL，实验组患者戴上蓝色过滤护目镜，并从术后立即开始在aBL 下照射18 h，结果显示：aBL 可以降低阑尾炎患者的血清细胞因子（白细胞介素6、白细胞介素10 和肿瘤坏死因子α）水平，同时能增强腹膜细菌的清除，减少菌血症和全身炎症的发生。临床试验［52］显示：aBL 可成功灭活患者胃中的幽门螺旋杆菌。aBL 还被用于医院隔离室的环境消毒，以灭活包括MRSA 在内的院内细菌［53］。

总之，aBL 在细菌感染性疾病中的临床试验研究均显示出了较好的细菌灭活效果，但其临床应用仍处于早期阶段。aBL 的强度、周期和波长等条件的进一步研究，对于优化其潜在的临床转化至关重要。随着研究的深入和发展，aBL 在细菌感染性疾病中的应用会越来越广泛。

4 总结与展望

aBL 作为一种安全高效的可以选择性灭活和根除微生物病原体的新方法，能够解决困扰全世界的细菌耐药性问题，可能会被更广泛地应用于临床，因此严格评估aBL 的有效性和安全性至关重要。尽管aBL 在体内外抗菌方面已经取得了很大进展，但为了能够充分和高效地实现aBL 疗法的抗菌效果，还需要进一步研究其作用机制和影响作用效果的相关因素。截至目前，细菌对aBL 能否产生抗性及aBL 对生物组织的影响等方面的研究较少，仍需要更多的体内外实验来进一步明确。