实时荧光定量PCR 法检测外周血中BCR/ABL基因表达在Ph+急性淋巴细胞白血病患者造血干细胞移植治疗中的应用

冯术青, 姚艳红, 史 月, 刘志彬, 高 峰

（华北理工大学附属医院血液科，河北 唐山 063000）

费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病（Philadelphia chromosome positive acute lymphoblastic leukemia，Ph+ALL） 是ALL 患者中常见的类型，在成人ALL 患者中占20%～30%，在儿童ALL 中约占5%［1］。Ph+ALL 患者以存在Ph 染色体为遗传学特征，Ph 染色体是第22 对染色体长臂和第9 对染色体长臂交互异位产生，转录为BCR/ABL 融合基因，产生酪氨酸激酶［2］。在酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI） 问世以前，异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，Allo-HSCT） 是治疗Ph+ALL 的标准方法，若无Allo-HSCT，Ph+ALL 患者无进展生存（progressionfree survival，PFS） 率低于20%，中位生存期仅为8～16 个月。在TKI 时代，Allo-HSCT 仍然是此类患者的标准巩固治疗方案［3］。但有研究［4］结果显示：自体造血干细胞移植（autologous hematopoietic stem cell transplantation，Auto-HSCT） 和单倍体相合造血干细胞移植（haploidentical hematopoietic stem cell transplantation，Haplo-HSCT） 可获得与Allo-HSCT 类似的治疗效果。无论患者治疗方案如何，在Ph+ALL 患者中，分子生物学反应尤为重要。美国综合癌症网（National Comprehensive Cancer Network，NCCN） 指南推荐采用实时荧光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR） 法检测BCR/ABL 融合基因以评估Ph+ALL 患者的微小残留病（minimal residual disease，MRD）［5］。研究［6］显示：治疗后MRD 阴性患者较MRD 阳性患者预后更好，复发率明显降低。目前能否根据MRD 结果选择Auto-HSCT 或者Allo-HSCT 尚无定论，HSCT 后是否需要TKI维持治疗，何时开始维持治疗以及维持治疗时间等问题，目前仍未达成共识。本文作者回顾性分析本科就诊的20 例Ph+ALL 患者，主要根据MRD 结果，并结合患者年龄及治疗意愿选择Auto-HSCT或Allo-HSCT，术后依据MRD 结果给予分层干预治疗，取得了较为满意的疗效，为今后Ph+ALL 患者治疗方法的选择提供了初步的参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料

回顾性分析2009 年10 月—2020 年10 月于本院进行造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT） 的20 例Ph+ALL 患者，其中男性9例，女性11例，中位年龄32（14～61） 岁。按移植前疾病状态分组： 完全缓解（complete remission，CR） 1期（CR1） 15 例，CR2 期（CR2）1 例，CR3 期（CR3） 1 例，未缓解（no remission，NR） 3 例。按移植类型分组： Auto-HSCT 3 例；Allo-HSCT 17 例，其中同胞全相合造血干细胞移植（matched sibling donor hematopoietic stem cell transplantation，MSD-HSCT） 4 例，亲缘间单倍体造血干细胞移植（haploidentical hematopoietic stem cell transplantation，Haplo-HSCT） 13 例。诊断至移植中位时间为8 （5～34） 个月。

1.2 Ph+ALL 诊断和研究对象纳入及排除标准

Ph+ALL 诊断标准：根据骨髓细胞形态学、免疫表型、细胞遗传学、分子生物学（morphology，immunophenotype，cytogenetics，molecular biology，MICM） 进行诊断分型。骨髓细胞形态提示原始幼稚淋巴细胞＞0.20 诊断为ALL。对于免疫表型分析提示B 细胞ALL 的患者，采用R 显带技术进行染色体核型分析。同时采用RT-qPCR 法检测BCR/ABL 融合基因以确定Ph+ALL 的诊断，并监测MRD，BCR/ABL 融合基因表达阳性即定义为MRD 阳性。

纳入标准： ①经过MICM 分型诊断确诊为Ph+ALL 的患者；②年龄14～65 岁；③Allo-HSCT患者有健康的合适供者，且符合伦理要求；④患者充分理解HSCT 相关风险并自愿签署知情同意书。

排除标准：①患者有严重的重要脏器功能损害；②并发严重感染或持续感染且不能得到有效控制者。

1.3 RT-qPCR 法检测BCR/ABL 基因表达

具体实验操作见参考文献［7］ 中的方法。

1.4 移植前治疗

15 例本院初治Ph+ALL 患者诱导治疗均采用以伊马替尼（imatinib，IM） 为代表的TKI 联合长春新碱+强的松（vincristine + prednisone，VP） 方案化疗。Auto-HSCT 组患者的化疗方案为TKI 联合超剂量环磷酰胺+长春新碱+柔红霉素+地塞米松 （hyper cyclophosphamide+vincristine +daunorubicin + dexamethasone，Hyper CVDD） 巩固并强化5 个周期后进行。Allo-HSCT 组患者均采用TKI 联合环磷酰胺+长春新碱+阿糖胞苷+柔红霉素+ 强的松（cyclophosphamide+vincristine+cytarabine+daunorubicin+prednisone，COADP）和TKI 联合大剂量甲氨蝶呤（high dose methotrexate，HD-MTX） 各1 周期强化治疗后进行。5 例复发患者中2 例在接受TKI （达沙替尼）联合长春新碱+柔红霉素+强的松（vincristine +daunorubicin + prednisone，VDP） 方案再诱导化疗达血液学完全缓解（hematological complete remission，HCR），经过原方案巩固2 个周期后MRD 仍呈阳性而进行Allo-HSCT。其余3 例经多次化疗未达CR 的患者直接进行Allo-HSCT。所有患者均接受预防性鞘内注射（阿糖胞苷30 mg+甲氨蝶呤10 mg+地塞米松5 mg） 6 次，均未发生中枢神经系统白血病（central nervous system leukemia，CNSL）。

1.5 移植预处理方案和移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD）防治方案

1.5.1 预处理方案 Auto-HSCT 和MSD-HSCT组：改良白消胺/环磷酰胺（busulfan/cyclophosphamide，BU/CY）；Haplo-HSCT 组：改良BU/CY+ 兔抗人胸腺细胞球蛋白（rabbit anti human thymocyte globulin，rATG）［8］。

1.5.2 Allo-HSCT 组GVHD 预防方案 采用常规的环孢素A （cyclosporin A，CSA） +短程甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）+吗替麦考酚酯（mycophenolate mofetil，MMF），CSA 血药谷浓度维持在150～300 μg·L－1。

1.6 造血干细胞动员、采集和干细胞回输

异体移植供者皮下注射重组人粒细胞集落刺激因 子 （recombinant human granulocyte colony stimulating factor，rhG-CSF）（日本麒麟公司产品）5 μg·kg－1·d－1，自第4 天开始使用COBE Spectra 血细胞分离机采集外周血造血干细胞，所有供体经2～3 次采集均获得移植所需干细胞数。17 例Allo-HSCT 组患者回输单个核细胞（mononuclear cell，MNC） 中位数为9.68 （8.51～12.26） ×108kg－1，CD34+ 细胞中位数为5.65 （4.56～6.62） ×106kg－1。Auto-HSCT 组患者采用大剂量环磷酰胺（4.0 g·m－2） +rhG-CSF （5 μg·kg－1·d－1） 联合动员方案，同时使用COBE Spectra 血细胞分离机采集自体外周血造血干细胞，所有患者经1～2 次采集均获得移植所需干细胞数。3 例Auto-HSCT 患者回输MNC中位数为4.42（3.59～5.68）×108kg－1，CD34+ 细胞中位数为2.52 （2.05～3.68） ×106kg－1。异基因造血干细胞回输采用静脉推注法，每次以50 mL 注射器抽取采集物通过中心静脉缓慢推注入患者体内。自体造血干细胞在38 ℃～40 ℃水浴中快速复温后以输血器通过中心静脉快速回输。

1.7 移植后BCR/ABL 基因检测

所有患者均在移植后1、2、3、6、9 和12 个月进行规律的外周血BCR/ABL 基因检测，对于规律检测中出现BCR/ABL 基因阳性（MRD 阳性） 的患者给予干预治疗，并缩短BCR/ABL 基因检测周期为每月1 次。对于1 年内BCR/ABL 基因检测持续为阴性（MRD 阴性） 的患者，之后每半年检测1 次，直至移植术后3 年。

1.8 移植后干预治疗原则

1.8.1 Auto-HSCT 组 患者造血重建后，无论BCR/ABL 基因定量检测结果如何，均给予TKI 口服进行干预治疗，如出现基因水平的复发，建议立即行Allo-HSCT （前提为患者具有Allo-HSCT条件）。

1.8.2 Allo-HSCT 组 患者造血重建后，无论BCR/ABL 基因定量检测结果如何，均给予TKI 口服干预治疗，其后检测BCR/ABL 基因持续阴性者，TKI 口服干预治疗1 年后停用。如果前3 个月出现BCR/ABL 基因检测结果阳性，早期干预治疗主要以口服TKI 为干预治疗手段，3 个月后出现BCR/ABL 基因阳性者以减停免疫抑制剂联合TKI治疗为干预手段。

1.9 统计学分析采用SPSS 25.0 统计软件进行统计学分析。移植后患者总生存（overall survival，OS） 率以百分率（%） 表示，采用Kaplan-meier 生存模型进行评估。组间比较采用Log-rank 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 BCR/ABL 基因定量检测指导下的移植选择

15 例本院初诊Ph+ALL 患者在诱导治疗达CR后均接受了RT-qPCR 检测外周血BCR/ABL 基因作为MRD 评估指标，其中8 例患者经诱导治疗后MRD 阴性，依据患者年龄、体能状态和治疗意愿为3 例患者进行了Auto-HSCT ，其余5 例及另外7 例初治诱导后MRD 持续为阳性患者，后期均接受了Allo-HSCT。另外5 例均为在外院治疗复发后来本院治疗的患者，其中2 例在本院经再诱导化疗后达HCR，但外周血MRD 持续为阳性故选择了Allo-HSCT；其余3 例患者虽经多种化疗方案仍处于NR 状态，检测BCR/ABL 激酶区突变发现2 例为T315I 突变，1 例无突变，3 例患者及家属移植意愿强烈故最终均选择了Allo-HSCT。

2.2 Auto-HSCT 组患者干预治疗情况

Auto-HSCT 组3 例患者在造血功能重建后均接受了TKI 维持治疗，1 例口服IM 300 mg 每日1 次维持治疗，无严重的血液学毒性。另外2 例在接受IM 300 mg 每日1 次维持治疗中出现严重血液学毒性，分别于移植后6 和14 个月更换为达沙替尼50 mg 每日1 次维持治疗。3 例患者口服TKI 药物维持治疗至今，规律检测BCR/ABL 基因持续保持为阴性，最长随访52 个月，至今3 例患者均无病存活。

2.3 Allo-HSCT 组患者干预治疗情况

2 例移植前MRD 阴性的CR1 患者在造血重建后口服IM 300 mg 每日1 次维持治疗中出现血液学毒性且在其后的BCR/ABL 基因检测中持续阴性而未再予以干预治疗。另外3 例移植前MRD 阴性的CR1 患者造血重建后口服IM 300 mg 每日1 次维持治疗，其中2 例MRD 持续阴性，无严重血液学毒性等不良反应，于移植后1 年停用IM，患者至今均无病生存；另外1 例于移植后6 个月出现MRD转阳，采用减停免疫抑制剂和达沙替尼治疗无效，移植后9 个月时死于髓内复发。7 例移植前MRD 阳性的CR1 患者中，4 例患者移植后MRD 持续为阴性，均给予IM 300 mg 每日1 次口服维持治疗1 年后停用；另外2 例患者MRD 持续未转阴，改为达沙替尼100 mg 每日1 次口服和减停免疫抑制剂干预治疗无效，分别于移植后10 和15 个月死于CNSL 和髓内复发； 另外1 例患者移植后2 个月MRD 转阴，但在IM 维持治疗5 个月时MRD 再次转阳，遂改为达沙替尼100 mg 每日1 次口服和减停免疫抑制剂治疗，患者MRD 再次转阴，现持续达沙替尼治疗中。移植前3 例NR 患者在移植后均取得HCR，但MRD 持续阳性，其中伴有T315I 突变的1 例患者于移植后52 d 死于肺内感染，另外1 例患者在移植后2 个月采用早期减停免疫抑制剂，无GVHD 发生，于移植后6 个月死于CNSL 复发；1 例移植前无突变的NR 患者在移植后给予达沙替尼100 mg 每日1 次口服，于移植后7 个月死于髓内复发。移植前MRD 阳性的CR2 患者，造血重建后口服达沙替尼100 mg 每日1 次治疗，监测MRD 逐渐转阴，现持续口服达沙替尼中。移植前1 例MRD 阳性的CR3 患者，造血重建后给予口服达沙替尼100 mg 每日1 次和减停免疫抑制剂治疗，于移植术后125 d 死于Ⅳ度肠道排异。

2.4 随访情况

全组患者移植后均达到造血重建，粒细胞植活中位时间为14 （11～24） d，血小板植活中位时间17 （13～52） d。随访至2020 年12 月，中位随访时间为52 （3～111） 个月。全组患者3 年OS 率为（61.1±11.7）%。Allo-HSCT 组和Auto-HSCT 组患者移植后3 年OS 率分别为（52.8±13.4） %和100.0%，组间比较差异无统计学意义（P=0.178），Auto-HSCT 组3 例患者全部存活。移植前MRD 阴性组和移植前HCR 但MRD 阳性组患者3 年OS 率分别为（87.5±11.7） % 和（42.8±15.6） %，组间比较差异无统计学意义（P=0.065）。移植前NR 患者全部死亡。

3 讨 论

Ph+ALL 是一组高危白血病亚型［9］，预后差，在采用TKI 治疗前，Ph+ALL 的患者治疗反应差，复发率高，长期生存率低于25%［10］。但近年来随着TKI 的使用，Ph+ALL 患者的CR 率大幅提高［11］。目前，国内及国外指南均推荐化疗+TKI治疗缓解后，若有合适供者尽快行Allo-HSCT［12］，移植后进行TKI 维持治疗［13］，尤其对于移植后早期评估MRD 阳性的患者。由于考虑到寻找合适供者的难度及 Allo-HSCT 的相关并发症，Auto-HSCT 有可能是一些患者可采取的替代治疗［14］。尤其在儿童患者及使用TKI 联合化疗后3 个月内获得分子生物学缓解的低危成人患者中，Allo-HSCT 的地位已受到了挑战，已不再是唯一的治疗选择［15］。CHALANDON 等［16］采用IM+Hyper CVAD 方案对Ph+ALL 患者进行诱导化疗，缓解后161 例患者行Allo-HSCT，93 例患者行Auto-HSCT，结果显示： Allo-HSCT 组患者5 年PFS 率和OS 率分别为48.3% 和56.7%，与Auto-HSCT 组（分别为46.1% 和55.1%） 比较差异无统计学意义（P＞0.05）。吕梦楠等［17］报道：移植前接受TKI+化疗治疗达CR 的Ph+ALL 患者78 例，其中31 例行Auto-HSCT，47 例行MSD-HSCT，结果提示：Auto-HSCT 组和MSD-HSCT 组患者3 年无白血病生存（leukemiafree survival，LFS） 率分别为（51.1±9.7） % 和（55.8±7.5） %，3 年OS 率 分 别 为（71.8±8.5） %和（74.1±6.5） %，组间比较差异均无统计学意义（P=0.803，P=0.919）；全组78 例患者中22 例（28.2%） 死亡，其中Auto-HSCT 组患者的死亡率为29% （9/31），MSD-HSCT 组患者死亡率为27.7% （13/47）。本研究中20 例患者3 年OS 率为（61.1±11.7） % ，Auto-HSCT 组患者3 年OS 率为100.0%，Allo-HSCT 组患者3 年OS 率为（52.8±13.4） %，组间比较差异无统计学意义。本研究中Auto-HSCT 组患者3 年OS 率为100.0%，明显优于国内外报道，考虑可能与移植术后持续口服TKI 有关，目前国内外对Auto-HSCT 术后TKI 药物维持时间仍未达成共识［18］。本组患者由于病例数少缺乏统计学意义，尚需增加病例数以进一步评估其疗效。

MRD 是指CR 后仍然残留在血液中的少量白血病细胞，是2017 年NCCN 指南在CR 基础上提出的一项重要的预后决定因素，MRD 的监测对于危险分层和化疗方案的选择有一定的指导意义［19］。临床监测MRD 的常用方法是多色流式细胞术（multi-parametric flow cytometry ，MFC） 和RT-qPCR，2 种实验方法之间存在互补，RT-qPCR 灵敏性高，而MFC 特异性高［20］。因此，北美专家共识中优先推荐在骨髓标本中使用RT-qPCR 检测BCR/ABL 融合基因作为监测MRD的方法［21］。但目前国内外学者［22-23］均证实：以RT-qPCR 法检测慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia，CML） 患者的BCR/ABL融合基因，在外周血和骨髓标本中具有很好的一致性。因此，本研究以RT-qPCR 法检测Ph+ALL 患者外周血中BCR/ABL 融合基因作为MRD 的评估指标，不仅减少患者反复骨穿的痛苦，更为患者减轻了经济负担（RT-qPCR 法的检测费用低于MFC 法）。

对于Ph+ALL 患者，规律的MRD 检测是对预后评估、治疗方案的选择、提早干预以及延长患者OS 具有重要意义。目前大部分临床研究［24-26］表明：早期巩固治疗时达到MRD 阴性是反映患者预后的有利因素。日本造血细胞移植协会［27］在对432 例Ph+ALL 患者的资料进行回顾性分析时发现：移植前MRD 阴性患者在移植后的复发率明显低于MRD 阳性患者（分别为19% 和29% ）。吕梦楠等［17］报道：对于移植前达到s3CMR（在治疗后3 个月内达到CMR 且持续至移植） 的Ph+ALL 患者，Auto-HSCT 组和MSD-HSCT 组患者3 年LFS率、 OS 率和累积复发（cumulative incidence of relapse，CIR） 率组间比较差异均无统计学意义；但在未达到s3CMR 的患者中，Auto-HSCT 组患者3 年CIR 率明显高于MSD-HSCT 组。本研究中20 例Ph+ALL 患者，移植前MRD 阳性者均选择Allo-HSCT，MRD 持续阴性者则依据个人意愿选择Auto-HSCT 或Allo-HSCT，移植术后依据不同时间点BCR/ABL 融合基因定量水平的变化给予不同的干预治疗措施，结果显示：移植前MRD 阴性组患者OS 率为87.5%，移植前HCR 但MRD 阳性组患者OS 率为58.3%，组间比较差异无统计学意义，考虑可能与患者例数少有关，故仍需增加病例数以进一步统计疗效。

综上所述，采用RT-qPCR 方法检测BCR/ABL 融合基因可作为监测Ph+ALL 患者MRD 的有效手段，依据MRD 水平给予不同的治疗措施可改善患者的OS。随着TKI 在移植前后的应用，使Allo-HSCT 的地位受到了挑战，对移植前MRD 持续阴性的患者可考虑以Auto-HSCT 作为巩固治疗手段。