吉林省长春市手足口病患者流行病学特征及肠道病毒71 型VP1 基因特征分析

张兴国, 李晨光, 张智丽, 孙 宇, 崔 薇, 初 秋, 乔凤娟, 王宇冰, 孙炳欣

（吉林省长春市疾病预防控制中心微生物检验所，吉林 长春 130033）

手足口病是一种常见于5 岁以下婴幼儿及儿童的传染性疾病，肠道病毒71 型（enterovirus 71，EV-A71）和柯萨奇病毒A组16型（Coxsackieevirus 16，Cox-A16） 是引起手足口病的主要病原体［1］，其中EV-A71 更易导致神经系统重症甚至死亡［2］。2008 年手足口病作为丙类传染病纳入我国法定传染病管理系统，并按要求进行报告［3］。吉林省最早的手足口病病例报道于1984 年，感染病原体为Cox-A16［4］，2008－2009年再次出现流行现象，发病主要集中在吉林省长春地区，主要病原体转变为EV-A71［5］，此后也一直以EV-A71 为主［6］。由于手足口病的病原具有多样性，而且不同血清型的病原之间常发生重组变异，导致每年的优势流行株发生变迁［7］。为了解吉林省长春地区手足口病流行情况，现对2014－2018 年收集的手足口病病例标本进行检测，对手足口病流行特征及EV-A71 VP1 基因特征进行分析，为手足口病防控策略的制定及疫苗株的挑选提供基础数据。

1 资料与方法

1.1 资料来源

收集2014－2018 年中国疾病预防控制信息系统中吉林省长春地区医疗机构报告的手足口病例的流行病学相关资料；病原学检测数据来自吉林省长春市疾病预防控制中心手足口病网络实验室，人口资料来源于吉林省长春市统计局。

1.2 标本来源

2014－2018 年，经吉林省长春市14 家县市区疾控中心采集的，来自吉林省长春市市区及开发区的6 家医疗机构（长春市传染病医院、长春市儿童医院、吉林大学第一医院、吉林大学第二医院、中日联谊医院和长春中医药大学附属医院） 和附属县市区的5 家医疗机构（榆树市医院、长春市双阳区医院、德惠市医院、农安县医院和长春市九台区医院） 临床诊断的部分手足口病病例标本。

1.3 诊断标准

按照《手足口病诊疗指南（2018 年版）》［8］中诊断标准进行诊断。①临床诊断病例。在流行季节发病，常见于学龄前儿童，婴幼儿多见，发热伴手、足、口和臀部皮疹，部分病例可无发热。极少数重症病例皮疹不典型，临床诊断困难，需结合病原学或血清学检查做出诊断。②确诊病例。临床诊断病例具有下列结果之一者即可确诊： 肠道病毒（ Cox-A16 和EV-A71 等） 特异性核酸检测阳性；分离出肠道病毒，并鉴定为Cox-A16 、EV-A71 或其他可引起手足口病的肠道病毒； 急性期和恢复期血清Cox-A16 、EV-A71 或其他可引起手足口病的肠道病毒中和抗体有4 倍以上的升高。

1.4 标本采集

按照《手足口病预防控制指南（2009 版）》要求采集吉林省长春市各县市区医疗机构报告的部分手足口病临床诊断病例的标本，包括肛拭子、粪便和咽拭子等样本，共采集2 680 例。

1.5 病毒核酸提取和实时荧光定量PCR（realtime fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法检测

所采集样本采用全自动核酸提取仪（江苏硕世生物科技股份有限公司） 依据说明书步骤提取核酸。采用德国QIAGEN 公司肠道病毒RT-qPCR 试剂盒（210212），对样本中总肠道病毒、 EV-A71和Cox-A16 进行检测，其中EV-A71 阳性标本VP1区通过RT-qPCR 进行扩增。引物序列：EV-A71-VP1-F，5′-ATAATAGCACTAGCGGCAGCC-3′；EV-A71-VP1-R，5′-CAAGATGTCGGTTGACCACTC-3′。反应条件： 55 ℃、 30 min； 94 ℃、2 min；94 ℃、15 s，55 ℃、30 s，68 ℃、40 s，35个循环；72 ℃、10 min。PCR 反应产物采用毛细管电泳仪（卡夹QIAxcel，DNA Screening Cartridge）进行电泳并观察结果，检测到目的片段长度为1 000 bp 的标本送至生工生物工程（上海） 有限公司进行测序。

1.6 EV-A71 基因比对和进化树的构建

本研究采用LaserGene 软件包中MegaAlign 软件，对序列进行比对，截取VP1 区（891 bp） 进行后续分析。用于构建系统发生树的EV-A71 各基因型代表株的参比序列均来自美国国立生物技术信息中 心 （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov /）GenBank 数据库。采用邻接（neighbor-joining，NJ）法构建系统进化树，采用MEGA X 软件并设置bootstrap 值为1 000。

1.7 统计学分析

采用描述性流行病学方法对2014－2018 年吉林省长春市手足口病流行病学资料进行分析。采用SPSS 19.0 统计软件进行数据录入和统计学分析。地区分布和人群分布等计数资料的描述以率或构成比表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 吉林省长春市手足口病疫情概况

2014－2018 年吉林省长春市累计报告手足口病病例12 685 例，年均发病率为32.78/10 万，累计报告重症146 例，死亡2 例。

2.1.1 时间分布 2014－2018 年每年均有手足口病病例报告，流行趋势基本相同呈单峰分布。报告病例从6 月份进入快速上升期，7 月份达到高峰，8 月份逐步回落，呈明显的季节性。

2.1.2 地区分布 吉林省长春市2014－ 2018 年14 个县区均有手足口病病例报告，年均报告发病率前3 位的地区为高新区（129.14/10 万）、宽城区（102.17/10 万） 和经开区（100.98/10 万），报告发病率最低为榆树市（6.16/10 万）。

2.1.3 人群分布 吉林省长春市2014－2018 年报告的手足口病例中，男性7 464 例，女性5 221 例，男女比为1.43∶1，男性高于女性。患者以5 岁以下儿童为主，占发病总数的93.08%。随着患者年龄的增加，发病率呈逐渐下降趋势。主要分布在散居儿童，占发病总数的80.77%，其次为幼托儿童（15.01%），学生占4.00%。

2.2 病原学检测结果

对2014－2018年吉林省长春市手足口病2 680例样本进行病原学检测，共1 924 例核酸检测为阳性，占病例总数的71.75%。在1 920 例核酸检测阳性病例中，Cox-A16 阳性452 例，占阳性病例总数的23.94%；EV-A71 阳性678 例，占阳性病例总数的35.24%；其他肠道病毒阳性794 例，占阳性检出的41.27%。其中2014 和2017 年优势 型别为EV-A71，分别占比63.34% 和66.20%，其他年份为其他肠道病毒高发。吉林省长春市EV-A71 阳性样本各月份均有检出。2014 年3－9 月手足口病病毒型别以EV-A71 为主，2015 和2016 年EV-A71 型检出较少。2017 年5 月－2018 年5 月吉林省长春市手足口病监测病例中检出的手足口病病毒型别以EV-A71 为主，且呈逐渐上升的趋势，在2018年2月和5 月达到峰值，占当月病例的100%。见图1 和表1。

表1 2014－2018 年吉林省长春市手足口病患者的病原学构成Tab.1 Pathogenic compositions of patients with hand-foot-mouth disease in Changchun City of Jiin Province from 2014－2018［n（η/%）］

图1 2014－2018 年不同月份吉林省长春市手足口病患者EV-A71 阳性检出率Fig.1 Positive detection rates of EV-A71 in patients with hand-foot-mouth disease in Changchun City of Jilin Province from 2014 to 2018

2.3 EV-A71 VP1 区基因特征分析

2.3.1 进化分析 基于VP1 区（891 bp） 对本次实验获的146 条EV-A71 序列及EV-A71 各基因型和亚型参考株序列进行进化分析，结果显示：2014－2018 年手足口病病例中EV-A71 毒株相对集中，136条序列属于C4亚型，其余10条（2017年3条，2018 年7 条） 属于B5 亚型（图2）。所获得序列与EV-A71 的原型株同源性为82.3%～83.8%，与C4 亚型同源性为94.2%～97.5%，其中与C4a 亚型同源性较高，各株之间同源性为92.3%～99.8%。见图3。

图2 2014－2018 年吉林省长春市手足口病患者病原EV-A71 的VP1 蛋白系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of VP1 region of EV-A71 strains isolated from patients with hand-foot-mouth disease in Changchun City of Jilin Proince from 2014－2018

图3 2014－2018 年吉林省长春市手足口病患者病原EV-A71 基于VP1 区序列同源性分析Fig.3 Homology analysis on EV-A71 of patients with hand-foot-mouth disease based on sequences of VP1 region in Changchun City of Jilin Provice from 2014-2018

2.3.2 变异位点分析 选取所获得序列中的代表序列通过MEGA X 翻译获得氨基酸序列进行变异位点分析，其中VP1 区145 氨基酸位点为E ，2018 年2株（ccHFME2018008 和ccHFME2018003）检测到VP1104D，另外3株（ccHFME2018043、 ccHFME2018044 和ccHFME2018041） 检测到VP1218R； 与C4 亚型比较，B5 亚型有VP143E、VP158T和VP1184T3 个氨基酸位点差异，其余各株主要毒理位点和抗原性位点未发生变异。见图4。

图4 2014-2018 年吉林省长春市手足口病患者病原EV-A71 的VP1 区氨基酸变异位点Fig.4 Variation sites of amino acid in VP1 region of EV-A71 of patients with hand-foot-mouth disease in Changchun City of Jilin Province from 2014 to 2018

3 讨 论

手足口病是一种常见于儿童的自限性急性传染病，其传播途径复杂，发展速度较快，少数重症患者可出现严重并发症，甚至危及生命［8-9］。EV-A71是一种快速传播的病原体，会导致手足口病，在世界范围内造成了严重的疾病负担［10-11］。

2014－2018 年，吉林省长春市累计报告手足口病病例12 685 例，年均发病率为32.78/10 万，其中2014 和2017 年优势型别均为EV-A71，其他年份为其他肠道病毒高发。从时间来看，吉林省长春市手足口病阳性样本各月份均有检出，发病具有明显的季节性，6～8 月病例数明显增多，夏季高发，2014 年3－9 月和2017 年5 月－2018 年5 月，手足口病病毒型别以EV-A71 为主，呈逐渐上升的趋势。本研究手足口病患者中，男性7 464 例，女性5 221 例，男性高于女性，男女比为1.43∶1；患者年龄分布较为集中，多数病例为5 岁以下儿童，与国内相关报道［12-13］一致。可能是因为男孩更为活泼好动，户外活动较多，增加了暴露和感染的风险［14］。

世界范围内流行的EV-A71 包括A～F 6 种不同基因型，其中主要流行型别为B 和C 型，其中B 型又包括B0～B5 6 个亚型，C 型包括C1～C5 5 个亚型，我国主要流行型别为C4 亚型［15-16］。本研究获得的146 条序列中136 条为C4 亚型中的C4a 型，与国内流行趋势一致。B5 亚型为一种只在亚洲流行的型别，日本、马来西亚、文莱和新加坡多次有暴发检出［17-18］，近年来我国台湾省、 江苏省、 厦门市、重庆市和昆明市等地有检出，此次检出10 条序列为B5 亚型，需持续监测。VP1 蛋白是肠道病毒分子结构中重要的结构蛋白［19］。通常肠道病毒的分类可以通过VP1 区域的核苷酸差异来定义［20-21］。EV-A71 VP1 蛋白包含297 个氨基酸，位于衣壳区最外部，包含重要的中和表位。EV-A71 VP1 蛋白145 位氨基酸位点是研究最多的毒力位点［22-23］，存在VP1145G、VP1145Q和VP1145E3 种类型，本次实验所获序列均为VP1145E，为手足口病患者中最为常见的类型。VP1N104D可能是影响感染能力的表位［24］，2018 年有2 株病毒检测到有此变异，另外有3 条检测到VP1K218R，可能会影响疫苗免疫效果，引起免疫后逃逸，需要密切关注并持续监测。B5 亚型较C4 亚型多VP143E、VP158T和VP1184T3 个突变位点，其是否会引起广泛的流行还需进一步的研究监测。总之，对EV-A71 流行特征及变异情况进行系统分析并追溯其传播规律，对手足口病防控具有重要意义。