环氧二十碳三烯酸对缺血性脑卒中的多靶点作用

聂 欢综述， 刘文娟审校

脑卒中与缺血性心脏病、恶性肿瘤已经构成了大多数国家的三大致死疾病。脑卒中分为了出血性卒中与缺血性卒中，具有发病率高、致残率高及死亡率高的特点。本病的发病特点无论是给家庭还是社会都带来了巨大的负担。因此对缺血性卒中的发病机制及治疗一直是临床医学研究的重点。近年来，靶向治疗一直是备受关注，缺血性脑血管疾病本就是一个复杂的过程，环氧二十碳三烯酸(epoxy eicosatrienoic acid，EET)是花生四烯酸(arachidonic acid，AA)经细胞色素 P450 酶途径生成的，可形成四个区域异构体：5，6-EET、8，9-EET、11，12-EET和14，15-EET，EET自1980年代初期在肝脏中首次发现以来，受到越来越多的关注，目前已经在包括心脏、肺、胃肠道、肾脏以及脑在内的不同组织中研究了EET的不同功能。EET主要在神经元胞体中检测到，其表达向下延伸至人额叶皮质、海马、基底神经节、杏仁核和小脑的轴突和树突[1]。EET在脑中已被证明有扩张脑血管、调节脑血流量、抗炎、抗凋亡、抗氧化以及直接的保护神经细胞，新型胶质细胞以及内皮细胞的作用。这种对血管、神经、内皮细胞以及星形胶质细胞的多重保护作用，有望成为脑梗死后治疗的新物质。

1 EET对组织缺血缺氧的保护作用

EET能够减轻组织的缺血再灌注损伤，其在脑、心脏、肺组织中都对缺血再灌注损伤具有保护作用，CYP2J2过表达可以减轻脑组织以及心肌组织的缺血再灌注损伤。在内皮特异性过表达人CYP2J2的小鼠中，于缺血再灌注后与野生型小鼠对比，损伤体积明显减小[2]。并且在缺血或者缺氧条件下，EET的产生都会增加这就提示EET可以作为抗缺血性脑损伤的内源性神经保护剂。在脑组织中EET已被证明具有抗炎、抗凋亡、促血管生成和血管舒张作用，并且可以抑制新型胶质细胞聚集、瘢痕形成、小胶质细胞激活、神经元凋亡从而减小脑梗死面积[3，4]。那么EET具体如何发挥脑保护的作用，也是近年来各个学者研究的热点。

1.1 EET对脑血管及脑血流的作用 EET对血管的舒张作用已经在脑血管、冠状动脉、肾脏、骨骼肌、颈动脉、肠系膜动脉中被证明。近年来CYP450衍生的EET被认为是血管功能和脑血管血流的新型介体。在大脑中，EET的释放有助于改善脑血流并且其在调节脑血流量中的作用超出了在外周循环中扩血管的作用。除内皮细胞和神经元外，星形胶质细胞也可以产生EET，星形胶质细胞是脑内神经-血管偶联的重要物质，它将神经系统突触和周围的微循环连接起来。它是通过刺激代谢型谷氨酸受体(mGluRs)来感知神经元的活动，从而释放P450类花生酸来扩张邻近小动脉并增加血流，EET和mGluR对急性缺氧时的脑血流量(CBF)有显著增加作用，mGluR可能在信号级联的上游起作用[5]。血管舒张的机制为何，研究发现 EET一方面促进星形胶质细胞KCa通道的开放，产生足够的K+，使血管平滑肌内向整流K+通道开放，导致脑小动脉超极化和血管扩张。另一方面，EET以旁分泌方式直接打开脑血管平滑肌细胞的KCa通道，导致脑小动脉的超极化和扩张[6]。Earley等也研究表明，11，12-EET刺激脑动脉平滑肌细胞瞬时受体电位香草酸亚型4(TRPV4)诱导超极化，增加Ca2+的释放促进血管舒张[7，8]。

EET除了对大脑动脉有舒张的作用，还会对脑循环产生非血管舒缩作用。星形胶质细胞衍生的EET在体外与体内都有促进血管生成的作用。在各种体外和体内模型中，外源性给药 EET 已被证明可诱导内皮细胞增殖和血管生成[9，10]。脑微血管内皮细胞在皮质星形胶质细胞共培养或暴露于星形胶质细胞条件培养基时，会出现增殖并表现出自发的管状结构形成。有研究发现14，15-EET显著增加了vWF和CD34阳性血管数量，从而证明了CYP-EET信号可以促进缺血后的血管生成[11]。这种活性的机制与 PI3K/Akt 和 MAPK信号转导级联中的蛋白质激活以及增加血管生成的生长因子表达有关[12]。也有研究在肿瘤模型中表明 8，9-EET 刺激的血管生成可以通过COX-2 代谢生成的11-羟基-8，9-EET(8，9，11-EHET)而增强，这种作用可能是通过血管内皮生长因子受体(VEGRF)信号通路介导[13]。虽然 EET 激活了几种不同的血管生成信号级联，但最近的证据表明，EET 血管生成活性可能进一步依赖于由环氧合酶 (COX) 形成的下游代谢物。

EET被多种细胞释放，通过对脑血管的扩张，增加脑血流量以及增加血脑血管生成对脑组织产生多方面的保护作用。目前的研究表明舒张血管作用与激活血管平滑肌肌膜上离子通道开放有关。血管生成作用可能归因于诸如丝裂原活化蛋白激酶等信号通路有关。

1.2 EET对神经血管单位的保护作用 与外周不同的是，EET除了对血管的作用外，还作用于中枢神经系统特有的细胞，是中枢神经系统细胞间的关键整合者，可以协调不同细胞间的应答。在脑缺血的环境下，EET生成会增加，并且就通过保护内皮细胞、神经胶质细胞和神经元从而保持神经系统所必须的细胞网络。EET对神经血管单位的几个组成部分：神经元、星形胶质细胞和血管内皮可以产生直接并且独立于血流的细胞保护作用。

EET对血管内皮的作用进行了广泛的探索。在脑血管中，内皮细胞的稳定性是脑缺血再灌注后恢复情况的一个重要因素。14，15-EET保护了雄性和雌性内皮细胞免受氧-葡萄糖剥夺(OGD)诱导细胞死亡[14]。在脓毒症小鼠模型中，EET通过减少GRP78-Src相互作用降低Src活化，随后抑制活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)生成、Rho-ROCK活化，有助于降低人血管内皮钙黏蛋白和肌球蛋白轻链磷酸化，从而增加血管的稳定性[15]。同样的，EET对神经元的保护作用也是受到了重视，直接给予EET也可以以非血流依赖的方式保护神经元免受OGD和氧化应激诱发的细胞死亡，增加了神经元的存活率。14，15-EET促进了皮质神经元的轴突生长[16]也促进了原代培养的大鼠海马神经元突起的生长。这可能是通过产生钙内流从而有助于神经突起生长，并且这种作用可能与TRPV4通道有关[17]。但由于14，15-EET可以激活多种离子通道，包括钙激活钾通道和电压门控钙通道，由于在在实验中有没探讨其他离子通道，所以也不排除14，15-EET在这些离子通道上引起钙内流。星形胶质细胞是中枢神经系统中最丰富的胶质细胞群，是神经血管单位的重要组成成分[18]。将 EET 应用于培养的星形胶质细胞可提高 OGD 的存活率[2，19]并保护星形胶质细胞线粒体免受 β-淀粉样蛋白毒性[20]。星形胶质细胞可以产生很多神经营养因子，包括NGF、GDNF、BDNF、NT-3、NT-4/5等，在神经保护中起着重要的作用。研究表明14，15-EET通过BDNF-TrkB-Erk1/2信号通路提高星形胶质细胞的活力，保护神经元免受OGD/R损伤。这证实了14，15-EET介导的星形胶质细胞源性BDNF的产生对于增强星形胶质细胞的活力和保护神经元免受缺血损伤的重要性[19，21]。

EET对神经胶质细胞、内皮细胞、神经元的保护作用，也反过来增加细胞生成EET，产生良性循环。EET在局灶性脑缺血后可发挥多靶点保护作用，包括抑制炎症因子，减少神经元凋亡，抑制星形胶质细胞增生和小胶质细胞活化，促进血管生成。虽然需要进一步的研究来揭示EET的下游靶点和机制，但CYP-EET信号可能是治疗缺血性卒中的一个有希望的治疗靶点[11]。

1.3 EET的抗炎作用 在脑梗死后，炎症反应可以进一步加重脑损伤，并且脑梗死后的炎症反应治疗时间窗大于原发性缺血性损伤，那么对于大多数超时间窗的脑梗死患者来说，抑制脑梗死后的炎症反应对其是十分必要的，所以也有大量实验证明EET具有抗炎作用。产生EET的内皮CYP酶的过度表达限制了MCAO后的炎症反应[22]。磷脂酶A2(PLA2)、环氧合酶-2(COX2)和前列腺素E2(PGE2)被认为是中枢神经系统重要的炎症标志物。11，12-EET可降低脑缺血再灌注后SD大鼠脑内PLA2、COX2和PGE2的蛋白表达水平，并改善神经炎症、脑梗死体积和脑水肿[23]。EET的抗炎基因组作用包括部分抑制IκB激酶及随后的NFκB活化和炎症信号传导，包括抑制内皮细胞上促炎细胞因子和粘附分子的表达。其还激活核红细胞相关因子-2(Nrf2)，诱导抗氧化蛋白和酶的表达。在细胞水平上，它通过调节内质网应激反应和维持线粒体功能来维持内质网线粒体内稳态和限制活性氧形成[24]。STAT1/3 信号是参与小胶质细胞诱导炎症的其他重要途径。外源性 EET 给药抑制了体外STAT 3 的激活[25]。此外，EET可以抑制局灶性缺血后小胶质细胞的活化，减小脑梗死面积。也已被公认为在多种情况下具有抗炎特性，例如脂多糖诱导的炎症[26]。

1.4 EET的抗凋亡作用 PI3K/AKT是一种跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶信号通路，参与细胞生长、增殖和分化，尤其是缺氧-缺血和再灌注期间的细胞凋亡[27，28]。大量实验证明EET还可以通过PI3K/AKT途径发挥抗凋亡作用。外源性EET和CYP2J2过表达增强了PI3K/AKT通道的激活，并且增加了抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的水平，减弱了促凋亡蛋白Bax的表达和caspase-3的升高从而使得小鼠全脑缺血模型中细胞凋亡数减少[2]。14，15-EET 也可以通过调节 PI3K/AKT/CREB/Bcl-2 信号通路来抑制缺血再灌注过程中的线粒体凋亡。在内皮细胞过度表达CYP2J2基因(Tie2-CYP2J2-Tr)的转基因小鼠中，14，15-EET水平升高，Tie2-CYP2J2-Tr小鼠双侧颈总动脉闭塞后，局部脑血流量(rCBF)和微血管密度显著增加，ROS生成减少，脑梗死面积和神经元凋亡减少。实验证明了PI3K/AKT通路的激活发挥了神经保护作用[29]。脑平滑肌细胞(CSMCs)是脑缺血再灌注过程中神经血管单位的组成部分，在神经元损伤中起重要作用。14，15-EET通过体外的JNK/c-Jun和mTOR信号通路，在OGD/R条件下减弱CSMCs中的氧自由基水平并抑制CSMCs的凋亡[30]。一项研究中认为PI3K/AKT的激活与KATP的上调有关，上调了其亚型Kir6.1 和 SUR2B 的表达[31]。在体外，PI3K/AKT途径和KATP通道都介导了14，15-EET对OGD诱导的脑微血管SMCs凋亡的保护作用。14，15-EET还可以通过激活星形胶质细胞中的PPAR-γ/p-CREB信号通路促进BDNF的合成和分泌，从而减少神经元凋亡[19]。

2 小结及展望

EET对脑缺血有着多靶点，多机制作用。除以上之外EET还被证明有调节血小板聚集的作用，但其具体机制还需要进一步研究。综上所述，在脑缺血的初期，EET的抗血栓和血管活性作用有助于维持局部和侧枝血流，同时减少细胞凋亡，抑制炎症因子。在缺血再灌注时期，其也发挥着重要抗炎和抗凋亡作用，在恢复期，还具有促进血管生成的作用，有助于脑梗死的后期康复。而目前实验证明，EET在体内直接给药会被很快代谢掉，并且EET的化学结构也不稳定。可溶性环氧化物水解酶(sEH)是EET内源性代谢的主要途径。因此抑制sEH有望增强EET对缺血性脑血管疾病的保护作用。再者可以通过口服EET的类似物增加外源性EET，EET-A就是一个稳定的EET类似物，并且具有良好的生物学活性。EET对脑组织的保护作用贯穿了脑梗死的整个演变过程，其有望成为脑梗死治疗中的一个具有前景的药物。