地中海贫血实验室筛查和诊断方法进展

黄来凤

（天等县妇幼保健院 广西崇左 532800）

地中海贫血（以下简称“地贫”）是一种自体隐性遗传疾病，往往由于亲代自身遗传的α、β珠蛋白基因缺失，使子代血红蛋白（Hb）中一种或多种珠蛋白链缺如或不足，引发贫血问题。地贫好发于东南亚地区，在我国广西、广东地区较为多见。地贫根据缺失的珠蛋白链种类和程度进行分型，一般以α-地贫与β-地贫较为常见与典型。这其中α-地贫患病率更高。若亲代双方均为同型地贫携带者，则子代有25%的几率遗传、发展为重型地贫[1]。针对此类情况，建议采取人工流产，实现优生优育。为了及早检出地贫问题，予以产妇甚至孕前检测者更科学的妊娠指导，就需要开展针对地贫的孕前、产前检查工作。本次研究，主要探讨地贫的实验室筛查技术研究现状。基因检测一直是地贫诊断的金标准，因此本文还就地贫的基因检测研究现状进行总结，详情见下。

1 原则

在地贫问题的预防控制上，临床主张孕前检查，必须接受产前检查，以及时发现问题妊娠并予以干预，响应优生优育政策。关于地贫的防控，临床主张先筛查、后诊断。筛查技术分多种，且相较于诊断技术更加安全、高效、经济性佳；但不足之处同样存在，即有一定的误漏诊几率。因此针对筛查示阳的受检者，建议接受进一步的基因诊断，以更好地确诊是否为地贫基因缺如人群。

基因检查的优势在于准确性高，但缺点在于费用同样高昂，且技术的开展十分依赖专业设备与人员，部分基层医疗单位往往不具备基因检查条件，因此基因检查不适用于地贫的“筛查”，建议作为地贫防控工作的确诊工具。

2 筛查试验

2.1 红细胞形态检查李敬[2]在其研究中证实，地贫患者的血液涂片普遍存在红细胞体积不一致的问题，甚至红细胞存在大量的不规则形态，最典型的有靶形、泪滴形、嗜碱性点彩红细胞等。靶形红细胞属于十分常见的不规则形态，微观下显示为中心颜色深、周围颜色浅、边缘颜色深的“标靶”形状，十分好辨别。在红细胞检查时，若发现大量的靶形红细胞，则需要警惕样本是否源自地贫患者。

2.2 血细胞分析血细胞分析因其操作便捷性及较高的地贫检出效果，获得临床广泛运用。近几年关于血细胞分析检出地贫的研究报道，多倾向于结合式的应用，即在其他检测基础上联合血细胞分析行综合诊断。郑琳等学者[3]所撰研究主要观察了平均红细胞血红蛋白含量(MCH)与平均红细胞体积(MCV)两种血细胞分析指标在地贫检查中的诊断效能，发现MCH、MCV 的诊断灵敏度、特异度均超90%，另外研究人员建议将MCH、MCV 两指标联合用于地贫的检测中，可获得最佳诊断效能。临床其他可用的血细胞分析指标还包括红细胞压积（HCT）、红细胞体积分布宽度（RDW）等。国际地中海贫血协会还推荐MCH 低于27Pg、MCV 低于78fI 为地贫筛查的截断值，该标准为临床筛查地贫提供了规范。

2.3 红细胞渗透脆性实验该实验主要是通过观察红细胞在不同低渗透压盐水中的抵抗力，以评估受检红细胞是否存在体积变小与形变的问题。当受检红细胞表面积与体积之比提升，其在低渗盐水中的吸水膨胀适应性越大，脆性越低，因此红细胞渗透脆性实验能够一定程度上鉴别地贫人群。冯志刚等学者[4]的研究显示，红细胞渗透脆性实验筛查地贫的敏感度可达78.6%，特异度可达94.1%，准确率可达91.9%，证实该筛查技术的应用有效性。但考虑到偏低的敏感度，建议临床将红细胞渗透脆性实验与地贫的其他筛查技术联合使用，以期提升检出效能。

2.4 血红蛋白组分析在地贫患者的筛查中，分离鉴定、定量分析Hb 有极高的诊断价值。血红蛋白组分析的主要对象为HbA2、HbH、Hb Bart’s 等,主要技术为琼脂糖凝胶电泳、毛细管电泳法、高效液相色谱法等。琼脂糖凝胶电泳是在碱性环境下，Hb经电场分离后染色，对Hb 琼脂糖进行定量分析[5]。毛细管电泳法中各种Hb 将毛细管作为分离管道，在电场作用下，受不同移动速度的影响，进而实现物质分离。毛细管电泳法具备操作便捷、安全经济等优势，同时结果分辨率高，只需少量样本即可检查。目前毛细管电泳法已成为孕前、产前地贫筛查的主要检查技术。林开颜等学者[6]总结提出，相较于血常规筛查，毛细管电泳法在α-地贫中的阳性检出率更高；而针对β-地贫筛查质量，毛细管电泳法与血常规筛查无明显差异。高效液相色谱法是利用离子交换树脂作为固定相，高压环境下，机体血红蛋白理化特性存在差异，因此在分离柱的停留时间不同，基于此实现Hb 分离。林青等学者[7]所撰研究对比了高效液相色谱法与血细胞分析技术在地贫检查中的准确率，结果高效液相色谱法显著高于后者。陆莹[8]所撰研究证实，相较于血常规分析，高效液相色谱法的诊断质量更高。总之，各种血红蛋白组分析技术在地贫筛查中的检出效能理想，值得关注。

3 基因检测

3.1 Southern 印迹杂交该检查技术的诊断机制是将受检者的基因组DNA 提取，再将通过限制性内切酶消化的DNA 片段以琼脂糖凝胶电泳进行分离，并转移至硝酸纤维膜上，再和放射性核素标记的RNA、DNA 探针杂交。酶解的DNA 片段位置与大小经由放射自显影技术检测。技术虽然具备一定的地贫检出率，但技术的开展环节十分众多，耗时费力，因此使用受到一定局限。但该项技术尤其适用于α-地贫的检测与大片段基因缺失的检测，因此被视为其他基因诊断的确诊实验。近几年国内缺乏Southern 印迹杂交技术检查地贫的研究报道，使后人的循证受阻。未来还需持续关注Southern 印迹杂交的应用进展。

3.2 多重PCR 和多重断裂点PCRPCR 的检查机制是经由DNA聚合物延伸引物，通过变形、退火、延伸等各项环节，完成特定DNA 片段的体外扩增。技术本身的应用较为便捷，对基层医院的推广较为友好。多重PCR 是PCR 技术的延伸产物，即在原本的PCR 基础上增加超过2 对的引物，并将多个核酸片段扩增。如此，可凭借各突变点特异性扩增产物，对检测结果进行判定，尤其在缺失型α-地贫与静止性α-地贫中检出效果好。多重断裂点PCR 技术的检查机制是通过在基因缺失区域设计2～3 对引物，并观察是否出现PCR 特异性扩增片段，进行基因型的判断。当然，医师也可根据正常的对照片段与阳性扩增片段，对受检者的地贫进行定性，界定其究竟是正常人群，抑或地贫杂合子、纯合子。该项技术在α-地贫的诊断中应用率较高，检出结果理想[9]。

3.3 PCR-反向点杂交法（PCR-RDB）骆明勇等学者[10]的研究中总结，经PCR-RDB 检查，165 份样本中PCR-RDB 检测结果与已知基因型完全一致，肯定了该技术在地贫诊断中的地位。PCR-RDB 的检查机制是通过在支持膜上将已知的寡核苷酸探针一一固定，再将PCR 产物加入其中，行液相探针杂交操作。PCR-RDB 技术能够对多种点的突变情况进行检查。学者们认为，PCR-RDB 技术本身检出效能理想、检测结果精准，同时对标本的消耗少，因此十分适用于临床推广。目前，PCR-RDB 主要应用于β-地贫的基因检测中，但技术开展过程中步骤较为繁琐，且最终结果的判定还会受到医师主观判断上的误读，因此需要加强学习，只有这样才能保障PCR-RDB 检出结果的准确性与高效性。另外，针对PCR-RDB 复核结果存疑者，建议进行复查。

3.4 基因芯片经由微电子技术、微加工处理的方式，在固相介质上，将已知序列的核苷酸探针固定其中，和已经被同位素、荧光素标记的核酸序列杂交。基于激光共聚焦显微镜，观察反应点荧光位置和强弱，得到一组完整互补的探针序列，并基于此将靶核酸序列重组。基因芯片的检查优势在于高效、便捷、灵敏性高，但经济性欠佳，现阶段的制作成本难以支撑基因芯片在临床的大规模使用[11-12]。

4 小结

本文介绍了以红细胞形态检查、血细胞分析、红细胞渗透脆性实验、血红蛋白组分析为典型的地贫筛查技术，以及以Southern 印迹杂交、多重PCR、多重断裂点PCR、PCR-RDB、基因芯片为典型的地贫基因诊断方法；并基于前人研究文献，概述了地贫筛查技术与基因诊断方法在临床的应用价值。通过搜集前人资料，笔者认为，各种地贫检测方法均有其应用场景，具体的检测方案选择，既要结合当下检测单位的自身条件，也要结合受检者的经济实力，在此基础上，选择最适合的检测方案，才是提升检出准确率、辅助医方妊娠指导工作开展的重要基础。未来笔者还将继续关注地贫检测与诊断的研究动态，不断提高自身学术视野，更好地将理论与实践结合，响应国家优生优育政策，为群众服务。