干细胞移植在糖尿病下肢血管病变治疗中的应用进展

李慧灵

（桂林市中医医院内分泌科，广西 桂林 541002）

糖尿病下肢血管病变（Lower extremity vascular disease，LEVD）是指糖尿病患者下肢血管尤其是中、小动脉出现的慢性进行性狭窄和闭塞。此病常伴有下肢感觉神经损伤。糖尿病LEVD 患者的早期症状主要是受累肢体出现冷感和疲劳感，多数患者缺乏外周动脉疾病的典型前期症状，如间歇性跛行和静息痛。因此，糖尿病LEVD 可能在患者出现明显组织病变前无法明确诊断[1]。糖尿病LEVD 若持续进展，最终可导致患者发生糖尿病足溃疡和坏疽，而糖尿病足溃疡和坏疽是导致非创伤性截肢的主要原因。LEVD 不是糖尿病患者特有的并发症，但糖尿病患者LEVD 的发生率明显高于非糖尿病患者。目前临床上治疗糖尿病LEVD 的方法较多，包括药物治疗、血管搭桥术、介入治疗、血运重建术等。但药物治疗的疗效不显著，而血管搭桥术和介入治疗的疗效受限于患者术后较高的下肢血管再狭窄率。生长因子、自体富血小板凝胶和局部二氧化碳的使用被认为有利于促进糖尿病足患者溃疡面的愈合，但最新的糖尿病慢性足溃疡干预指南明确表示不支持这一治疗方式[2]。此外，由于手术的风险高，因此有20% 以上的慢性肢体缺血患者因年老体弱或伴有弥漫性疾病、晚期疾病等自身原因而无法接受血管内介入治疗或血运重建术[3]。由此可见，探索更有效的治疗糖尿病LEVD 的方法势在必行。近年来，基于干细胞“治疗性血管生成”特性的干细胞移植技术已成为临床上治疗糖尿病LEVD 的研究热点。具有自我更新和多向分化增殖能力的干细胞在体内、体外的特定环境下均可定向诱导生成血管内皮细胞、平滑肌细胞等多种特定细胞，参与血管再生、组织损伤修复等过程，从而可恢复和改善下肢血流，达到治疗糖尿病LEVD 的目的。本文回顾了目前报道的采用干细胞移植疗法治疗糖尿病LEVD 的相关文献，概述了干细胞的类型及干细胞移植治疗下肢血管病变的相关进展，以获得关于干细胞移植作为糖尿病LEVD有效治疗手段的可靠证据，为下肢缺血性疾病的治疗提供参考和借鉴。

1 干细胞类型

干细胞是一类具有无限自我更新和多向分化能力的“万能细胞”。一般来说，可根据干细胞的发育阶段将其分为两大类，即胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESCs）和成人体细胞（adult stem cells，ASCs）。ESCs 亦 称 为 诱 导 多 能 干 细 胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs），具有全能性，可分化成成人身体器官或组织的任何细胞。ESCs 一般是在受精后4 ～5 d 内从胚泡内部的细胞团中获得的。ASCs具有组织特异性，其分化潜力具有局限性，一般存在于各类器官中，其在特定器官或组织中只能分化为该器官或组织的特殊细胞类型。ASCs 根据组织来源可分为造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）、间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、神经干细胞（neural stem cell，NSCs）和肌肉干细胞（muscle stem cell，MuSCs）等[4]。ASCs 因 具 有 分 化成各种特定细胞类型的内在潜力，且一直存在于人体组织内部，因此一直被认为是再生医学中的关键治疗元素，在干细胞移植治疗中受到了广泛重视。目前用于移植的干细胞通常有以下几种：iPSCs、HSCs、骨髓单核细胞（bone marrow mononuclear cells，BMMNC）、 内 皮 祖 细 胞（endothelial progenitor cells，EPCs）及包括脐带、脐血和骨髓等来源的MSCs。这些干细胞均有多向分化的潜能，可用于不同组织和器官的移植。

2 干细胞移植治疗的现状

1997 年有学者首次从血液中分离出EPCs，并发现其可以发育成血管内皮细胞，促进血管的重建。之后通过动物实验发现，EPCs 具有定向归巢的特性，能主动趋向移植肢体的局部缺血和血管损伤部位，并通过旁分泌血管生长因子〔如血管内皮生长因子（VEGF）等〕促进新生血管的形成，建立侧支循环，使缺血肢体的血液流动得到改善，从而改善肢体缺血的状态。2002 年，日本学者Tateishi-Yuyama E等首次在人体试验中通过骨髓干细胞移植治疗糖尿病LEVD，结果表明干细胞具有“治疗性血管生成”的作用，能明显改善和恢复糖尿病LEVD 患者下肢的血液灌流量，取得了令人满意的疗效[5]。国内夏稳伸等[6]通过对13 个干细胞移植治疗糖尿病LEVD 的随机对照试验（RCT）进行荟萃分析，发现干细胞移植组患者相比常规治疗组患者的踝肱指数（ABI）、经皮氧张力（TcPO2）、静息痛、肢体冷感、侧支血管新生及截肢率均有不同程度的改善。

2.1 自体骨髓干细胞移植

骨髓是人体中最丰富的干细胞池。BM-MNC 是具有自我更新和多向分化潜能的原始骨髓细胞。成年个体的BM-MNC 中包含骨髓来源的MSCs（BMMSCs）、EPCs、HSCs 等庞大的干/ 祖细胞成分，其中EPCs 的含量约占3%，超过外周血的15 倍。具有CD34+标记的BM-MNC 是EPCs 的主要来源，BMMNC 在特定条件下可分化为血管内皮细胞、平滑肌细胞，成纤维细胞等，且移植后可通过旁分泌VEGF等血管生长因子促进新生血管的形成和缺血损伤的修复。对后肢缺血家兔模型进行BM-MNC 移植4 周后，通过血管造影检查发现，局部移植BM-MNC 可产生功能性EPCs，有效促进家兔缺血后肢的血管生成和侧支血管形成。而对后肢缺血糖尿病大鼠模型进行实验发现，将骨髓干细胞局部肌内注射至大鼠的缺血肢体后，在其缺血后肢中实现了血液灌注的恢复。提示BM-MNC 诱导的治疗性血管生成可能是糖尿病LEVD患者的一种安全有效的治疗方法。马海涛等[7]对60例糖尿病LEVD 患者的36 条患肢进行BM-MNC 移植，移植20 周后经血管造影证实患者的ABI、TcPO2和血氧水平（BOLD）较移植前均有不同程度的升高，其缺血下肢的血流灌注量得到明显改善和恢复，新生血管和侧生血管形成明显增加，其截肢手术率明显降低。谷涌泉等[8]对糖尿病LEVD 患者实施自体BMMNC 移植治疗，发现治疗后患者的疼痛明显缓解，ABI 和TcPO2均明显升高，部分患者的间歇性跛行症状较治疗前明显好转，其截肢率和截肢平面明显降低。同时，该研究还证实了用经下肢动脉导管注射和肌内局部注射这两种不同的自体BM-MNC 移植方法治疗糖尿病LEVD 的效果并无显著性差异。这为自体骨髓干细胞移植治疗糖尿病LEVD 的临床应用提供了有力证据。存在于各种组织器官中的MSCs 具有多向分化潜能，通常表达CD90、CD105 和CD73 标记，在干细胞移植治疗方面受到了广泛关注。临床上治疗糖尿病足慢性不愈合溃疡最有效的方法之一就是自体植入BM-MSCs。有学者在大鼠下肢缺血模型中分别进行BM-MSCs 移植和BM-MNC 移植，结果表明BMMSCs 移植较BM-MNC 移植能更有效促进新生血管的形成。刘璠等[9]对比了用自体BM-MSCs 移植和BMMNC 移植治疗糖尿病LEVD 的疗效，结果显示，随访24 周后BM-MSCs 组患者的无痛步行时间、ABI、TcPO2、肢体血流灌注量和溃疡愈合率等指标相较于BM-MNC 组患者提升更为显著。表明在促进糖尿病LEVD 患者的下肢血流灌注和足部溃疡愈合方面，BM-MSCs 移植可能比BM-MNC 移植具有更好的耐受性和有效性。

2.2 外周血干细胞移植

虽然目前认为自体骨髓干细胞移植具有细胞采集操作简单、方便直接及费用较低等优势，但同时也存在需要局部麻醉、骨髓采集创伤较大、采髓量高、对患者身体状态要求较高及危险性较大等缺点，限制了该治疗方法的临床使用。外周血干细胞移植（peripheral blood stem cell，PBSCs）是通过应用粒细胞集落刺激因子（G-CSF）动员骨髓干细胞从骨髓分泌到外周血循环中，从而提高外周血中EPCs 和HSCs数量，以达到干细胞移植要求的一种治疗方式。正常状态下，外周血中EPCs 的含量极低，经过G-CSF 动员后外周血中EPCs 的含量可提高1% ～10%，再通过细胞分离机将外周血循环中的PBSCs 分离出来，用于干细胞移植。早期通过糖尿病肢体缺血动物模型证明，进行EPCs 移植治疗能有效改善糖尿病肢体缺血动物模型缺血肢体的血流灌注，促进其溃疡面的愈合。卢爱俊等[10]研究发现，糖尿病LEVD 患者在接受PBSCs 移植治疗后，其ABI、TcPO2等客观指标均得到提升，间歇性跛行得到改善，溃疡面愈合。提示通过PBSCs 移植可增强糖尿病足溃疡患者下肢的血液供应。研究表明，CD34+细胞似乎是一个丰富的EPCs群体，是治疗溃疡的良好候选细胞。上述研究均表明PBSCs 移植是治疗糖尿病LEVD 的一种简单、安全、有效的新方法。陈明卫等[11]比较了用自体BM-MNC移植和PBSCs 移植治疗糖尿病LEVD 的效果，发现用这两种干细胞移植疗法治疗糖尿病LEVD 的效果相当。然而，PBSCs 移植疗法在应用时由于需要长时间以G-CSF 动员骨髓单核细胞的形式进入外周血循环，因此容易会造成血液的黏稠度升高，引起血管内血栓形成，进而可增加患者心脑血管疾病的发病风险[12]。因此，在整个骨髓动员过程中，应注意为患者采取抗凝措施，以预防其出现心脑血管并发症。

2.3 脐血干细胞移植治疗

脐血干细胞（bilical cord blood stem cell，UCB）因其来源丰富且制备便利，现已成为HSCs 和EPCs的重要替代来源，越来越受到学者们的关注。脐血中CD34+细胞的含量为成人外周血中该细胞含量的10倍，且其增殖分化能力明显高于骨髓干细胞，产生EPCs 的能力更强。文献报道，UCB 移植可有效提高兔后肢动脉球囊损伤模型血液中一氧化氮（NO）的浓度，抑制血管内膜的增生，改善其损伤血管内皮的功能[13]。于凤泉等[14]研究证实，应用UCB 移植联合介入治疗可有效改善糖尿病LEVD 患者的VEGF、ABI、TcPO2和肢体冷感等客观指标，且相较于单独应用介入治疗，联合应用UCB 移植与介入治疗起效更快，且疗效更持久。马红芳等[15]研究表明，UCB 移植可明显促进糖尿病LEVD 患者新生血管和侧支循环的形成，改善受损血管内皮的功能，降低介入治疗后再狭窄的发生率，且UCB 移植与血管介入治疗两者联用相比单独应用介入治疗的疗效和远期预后更佳。

3 存在的问题与展望

用干细胞移植疗法治疗糖尿病LEVD 可有效改善和恢复患者的下肢血流灌注，促进血管新生。然而，大多数关于该疗法的研究都是通过糖尿病LEVD 动物模型进行的基础研究，关于该疗法的临床研究仍然太少。鉴于用干细胞移植疗法治疗其他慢性疾病（如高发病率的溃疡等）具有巨大的治疗潜力，因此有必要在人体受试者中进行更多的临床试验来证明其安全性、有效性和耐受性。同时，尽管自体干细胞是干细胞移植治疗中最常用的细胞类型，但未来更多地探索iPSCs 和异基因或异种干细胞移植仍是十分必要的。通过G-CSF，有助于动员骨髓干细胞分泌到外周血中，并促进伤口的愈合，因此建议将其作为外周血干细胞移植治疗的辅助手段。对于需要血运重建的糖尿病LEVD 患者，在行干细胞移植治疗的同时联合实施血管成形术是一种很有前景的治疗方式，但干细胞移植是否能被用作血管成形术的辅助治疗手段仍有待确定。此外，在干细胞移植治疗中，干细胞的数量和质量尤为关键。在许多干细胞移植治疗方案中，移植在患者体内的干细胞存活率很低，这是制约该治疗方案临床应用和推广不可忽视的障碍。除了细胞在体内存活的问题外，干细胞移植治疗的局限性还包括应用来自胚胎和脐带血异体干细胞的相关伦理问题、致畸潜力、对骨髓来源细胞侵入性收获技术的需求及免疫原性等问题。此外，不同研究之间的干细胞来源、移植细胞数量和细胞给药途径也不相同。考虑到干细胞的异质性，还有待大量高质量的临床随机对照试验对干细胞移植治疗的安全性、有效性及远期疗效予以证实，且建立一套行之有效的规范化治疗指南和完整、客观的疗效评价系统也势在必行。