过继细胞免疫疗法治疗胆管癌的研究进展

潘灏 侯波 彭鹏

胆管癌（cholangiocarcinoma,CCA）恶性程度极高，按照其发生部位可分为肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC）和肝外胆管癌（extrahepatic cholangiocarcinoma,ECC），其中ECC又可进一步分为肝门部CCA和远端CCA。CCA患病人群主要集中在60岁以上，东方国家部分地区CCA发病率为西方国家的10倍以上[1]。CCA的主要致病因素是肝硬化和病毒性肝炎，以及肝吸虫、胆结石、酒精、代谢疾病、吸烟、肥胖等[2]。目前治疗CCA的主要方法有手术、放化疗以及内镜治疗，但疗效均欠佳，晚期CCA患者因肿瘤转移导致生活质量极差。近年来免疫疗法越来越被人们关注，主要包括嵌合抗原受体（CAR）T疗法、肿瘤疫苗、免疫检查点抑制剂等，在血液系统恶性肿瘤尤其CD19阳性的疾病治疗方面效果显著，这些治疗措施有望结合目前的姑息治疗手段，成为未来治疗的新思路。本文就国内外CCA的过继细胞免疫疗法研究进展作一综述，以期为今后研究提供参考。

1 CCA的治疗现况

CCA首选外科手术治疗，但术后容易复发，并且因很多患者被确诊时已为中、晚期，错过手术机会。研究表明，ICC手术治疗创伤较大，患者多为老年人基础条件差难以耐受，后期病死率高[3]。且对于治疗肝门部CCA而言手术疗效欠佳，其5年的生存率仅为约30%，生存率极低[4]，由此看来手术治疗并不理想。化疗对于晚期ICC患者是较为普遍的治疗方式，且相对安全可行，研究发现联合使用吉西他滨和顺铂应用于晚期ICC患者有效，可相对提高患者寿命[5-6]。此外一项荟萃分析结果显示，配合放疗治疗ECC可控制肿瘤生长以及缓解患者临床症状[7]。国外一项入组117例恶性胆道狭窄患者的研究结果显示，经超声引导下经皮经肝胆道引流术治疗后患者的TBil明显下降[8]。此外，内镜治疗可直接针对病灶，内镜下射频消融能产生高温，可使肿瘤凝固性坏死，还可延长支架通畅期，延长患者寿命[9]。一项荟萃分析结果显示采用内镜下光动力疗法治疗CCA也有一定效果[10]。以上是当前的主要治疗手段。

2 过继细胞免疫疗法

过继细胞免疫疗法是指通过各种手段利用自体产生的针对肿瘤的免疫细胞进行改造和扩增，再重新输入人体，使其产生特异的抗肿瘤效应，依靠自体免疫杀死癌细胞，包括非特异性及特异性治疗。过继细胞免疫疗法主要利用IFN、TNF等产生的直接杀伤以及细胞因子激活免疫产生的间接杀伤效应起作用。这种方法理论上可以使恶性肿瘤达到根治，是一种十分有前途且亟待大力发展的治疗方向。

2.1 早期细胞免疫疗法 研究者早期首先通过改造杀伤性细胞进行尝试治疗 CCA，Takashi等[11]建立CCA小鼠模型，通过单克隆抗体西妥昔单抗联用被细胞因子激活的杀伤细胞（killer cells activated by cytokines,CAK）增强对CCA细胞的毒性。Takashi等[12]还发现在活化的自然杀伤细胞上出现的细胞受体NKG2D，在多种癌症中均有其配体，而采用活化的CD3+/NKG2Dhigh+T细胞联合化疗对入组23例已转移的CCA患者治疗有效，但疗效不佳，也不具有特异性。

因树突状细胞（DC）是一种高效抗原提呈细胞（APC），同时还可产生记忆T细胞。Takehiro等[13]通过载有天冬氨酸-β-羟化酶（ASPH）的DC治疗ICC模型大鼠，抑制了肿瘤的生长、转移，并可增加CD3+淋巴细胞浸润。

但癌症微环境和癌细胞本身产生的免疫抑制细胞因子会抑制免疫功能。Chutamas等[14]研究结果发现因CCA细胞能产生IL-10和转化生长因子（TGF）-β并分泌到肿瘤的微环境，这些因子抑制了DC功能并诱导产生Tregs；他们使用特异中和抗体，结果显示其可增强对CCA细胞的杀灭效应[14]。此外，Chutamas等[15]采用包含短发夹RNA的慢病毒转导单核细胞衍生出了树突状细胞（SD-DC），这使TGF-βRII和IL-10受体的表达降低约90%，但仍难以从根本上降低癌细胞的免疫抑制作用。

综上所述，采用改造杀伤细胞的CAK疗法特异性较差，难以有效杀死肿瘤细胞。而改造DC方案特异性相对较高，可提高对CCA的疗效，但癌症微环境和癌细胞本身产生的免疫抑制仍难以克服，因此还需进一步探索和研究，需要有效手段对抗肿瘤引起的强大免疫抑制。

2.2 肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes,TIL）疗法 为了提高治疗肿瘤的特异性和有效性，研究者发现TIL本身具有选择性，可特异性杀灭肿瘤细胞。这种肿瘤组织中的TIL，通过在体外培育和扩增来重新输注给患者自体的方法称为TIL疗法。TIL疗法主要通过IL-2刺激TIL从而体外培养出淋巴细胞，过继转移给患者最终产生抗肿瘤作用。美国国立卫生研究院于2014年报告1例43岁的伴有广泛转移的ICC妇女患者，采用TIL输注抑制其肿瘤生长达7个月，表明TIL具有抗肿瘤活性[16]。

肿瘤DNA常表现为基因突变，而新抗原是一种基因发生改变了的蛋白质，其可触发T细胞反应的主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex,MHC）分子的呈递作用。在包括CCA及多种上皮细胞癌中均证明了新抗原的触发效应[17]。但采用新抗原TIL治疗的患者需使用特定的输注药品，且药品生产周期长，往往赶不上肿瘤的生长速度[18]。

由此看来，TIL疗法目前应用仍不成熟，缺乏大数据验证，且生产过程耗费大量时间，制备过程及工艺复杂，无法高效应用于疾病的治疗，生产成本高、特异性不强等问题仍需解决，还有待未来进一步实验以及临床研究。

2.3 特异性T细胞受体（TCR）T疗法 随着科学技术的进步，研究人员开始逐渐探索出一种新的过继细胞免疫疗法，主要包括TCR和CAR[19]。其中TCR即使用正常的T细胞受体结构信号转导，可识别各种抗原，但修饰TCR时须注意其对正常抗原的作用。

Wang等[20]的一项研究采用人类白细胞抗原（human leukocyfe antigen-A,HLA-A）限制的小鼠T细胞，通过TCR转导人胰腺T细胞治疗鼠类肉瘤病毒癌基因突变的肿瘤免疫缺陷小鼠可抑制肿瘤生长。为解决MHC引起的免疫障碍，Roland等[21]尝试了一项CRISPR RNA引导的DNA修饰碱基编辑技术，其主要可通过HBV特异性重组T细胞受体（rTCR）来破坏基因的表达，最终导致HBV特异性人群增加了40%，表明TCR T疗法可用于改造免疫细胞以治疗肿瘤。

但TCR需基因修饰，对相关技术的要求较高，研发成本高，存在MHC限制，且会造成自身抗原的破坏，还需未来进一步探索和研发。目前较为成熟的TCR T疗法主要为CAR，癌细胞表面的特定肿瘤相关抗原（TAA）能被CAR T细胞特异结合，因此它可以绕开MHC识别TAA。2021年蒙露等[22]采用CRISPR/Cas9基因编辑研制的CAR T细胞，结果显示其在体外仍有杀伤效应，并可抑制排斥反应，但仍需未来进一步实验证明其有效性。

2.4 CAR T疗法 近年来CAR T疗法因兼具特异性及有效性被广泛关注。最早CAR T疗法是由Eshhar等[23]通过TCR的常区域结合单一抗体分子链可变区结构域（scFv），构建CAR基因，诱导产生表达这种基因的T细胞，这被称为第1代CAR；第2代CAR是指增加了一种刺激信号域CD28或CD137，可持续刺激T细胞分泌细胞因子，增强T细胞增殖；第3代CAR是指增加了2个或2个以上的共刺激域，可提高其增殖能力，但其临床疗效较第2代来说孰优孰劣仍不清楚[24]。国内张伟光等[25]研究结果发现靶向B细胞抗原的第2代CAR T细胞比第3代杀伤力更强。Chmielewski等[26]研究开发了第4代CAR，其包括共刺激域和CAR诱导的IL-12盒式磁带，除了可刺激T细胞产生，还可杀灭免疫逃避的肿瘤细胞，其抗肿瘤活性、增殖和存活均更强。因此目前CAR T细胞研究主要集中在第4代。

CCA患者进行CAR T疗法的重点是靶点的选择。Xu等[27]采用转座子系统的基因技术分析间皮素K562-meso的作用，结果证实66.0%的meso-CAR T可用于治疗胆道肿瘤细胞。Sangsuwannukul等[28]发现CD133是一种在癌症患者中与信号转导相关的细胞质伴侣，在67.6%的CCA标本中均可发现CD133表达，ICC中CD133为52.6%。采用以CD133为靶标的第4代CAR T细胞，在治疗后可观察到IFN-γ和TNF-α大量表达，表明此法有效。第4代CAR T细胞的存活能力及抗肿瘤能力使细胞免疫疗法治疗实体肿瘤成为可能，但完全治愈肿瘤目前还无法实现，仍需进一步研究探索。

研究人员还发现CD276免疫检查点分子（B7-H3）在ICC细胞和ICC启动细胞中表达丰富，而在正常组织中分布受限。B7-H3 CAR T细胞和移植了ICC细胞的小鼠细胞在体外用共培养，结果显示其可消除近乎100%的ICC细胞[29]。此外T细胞可在其表面表达Fc受体CD64，利用CD64CAR T细胞在体外培育也达到同样效果，表明此为有效的治疗靶点[30]，有望用于临床治疗恶性肿瘤。此外，Phanthaphol等[31]研究发现，一种由α和β亚单位组成的跨膜异二聚体（αvβ6）整合素在很多实体的肿瘤中含量丰富，但在正常上皮细胞中含量极低。第4代靶向整合素αvβ6的A20-4G CAR T细胞增殖能力更强，有望用于αvβ6阳性CCA的细胞治疗。

但CAR也有相应毒副反应。Feng等[32]采用CAR T鸡尾酒疗法对1例诊断为晚期不可切除肝门部CCA的女性患者连续注入靶向表皮生长因子受体（EGFR）和CD133的CAR T细胞；该患者治疗后，虽然得到了8.5个月的局部缓解，但输注CAR T细胞使患者产生了细胞因子释放综合征。因此对于CAR T治疗的不良反应仍需进一步研究。

一项针对晚期CCA EGFR阳性患者CAR的临床试验（NCT01869166）结果表明，5.8%的患者完全缓解，58.8%实现疾病稳定[33]。针对人表皮生长因子受体（HER2）过表达实体瘤的 CAR（NCT04660929），以及针对黏蛋白1（MUC-1）CART治疗ICC的安全性和有效性（NCT03633773）临床试验仍在进行中。

CAR T细胞针对实体瘤的治疗效果不佳。Siddiqui等[34]总结15项前瞻性临床试验共159例患者，这些试验结果总体上均表明各种恶性肿瘤与CAR T细胞发生反应的患者例数占各自实验设计总体患者的17%～100%，中位总体反应率为62%，但大多数试验未到中位无进展生存期和总生存期。最近Supimon等[35]将 MUC-1用作CAR T疗法的靶向抗原，结果表明抗MUC-1-CAR4 T细胞通过增加TNF-α和 IFN-γ、促凋亡蛋白等的产生，促进了共培养物中肿瘤细胞的裂解，表明抗 MUC-1-CAR4 T细胞对CCA有效。

从上述文献可知，虽然研究者们通过各种靶点针对CAR T细胞进行改造，但CAR T细胞仍很难杀死全部的肿瘤细胞。CAR T细胞只能针对肿瘤细胞表面的其中某一类抗原起效，并且肿瘤组织层次分明的排列使CAR T细胞很难渗透到内部，虽然第4代CAR细胞较前几代有一定改善，但实体瘤的免疫抑制作用仍然强大。仍需要大量的前瞻临床实验和研究，有待进一步的探索。

2.5 联合治疗 Reinhard等[36]研究发现一种纳米RNA疫苗在特异性刺激CAR-T细胞后可提高CART细胞对肿瘤细胞的杀伤效应，表明此联合治疗方法比单一CAR-T疗法更有效。γδT细胞是一种执行固有免疫的T细胞，不受HLA限制，因此具有适应性免疫的特性以及强大的细胞毒性。研究发现通过健康人体血液中的单个核细胞扩增可得到γδT的细胞，将此细胞过继转移到患者体内有治疗作用[37]。一项国外研究中，1例ICC患者在肝移植后发生了纵隔淋巴结的肿瘤转移，使用γδT细胞疗法进行8次治疗后，转移淋巴结明显缩小[37]。DC是最有效的可诱导适应性免疫并支持独立于T细胞先天免疫应答的APC，γδT细胞与DC联用可协调治疗效果[38]。此外Farsaneh等[39]研究发现免疫检查点CD40/CD40L的体外激活可以改善DC对胆管肿瘤的细胞毒副反应，促进Th1细胞因子/趋化因子的生成。由此看来联合的细胞免疫治疗相对更具优势，未来可在此方面继续加强研发。

3 小结及展望

CCA的过继细胞免疫疗法利用自体产生的针对肿瘤的免疫细胞进行改造和扩增，培养后重新输入人体使其发挥抗肿瘤作用。当前较为成熟的是第4代CAR T细胞治疗，可一定程度改善免疫抑制，但仍很难杀死全部的肿瘤细胞。联合细胞治疗相对更具优势，需未来进一步探索研究。目前药物的靶点选择、疗效的长期稳定性、毒副反应的减轻、生产成本的降低等问题仍需解决，相信随着科技发展，细胞免疫疗法在CCA上前景将会更加广阔。