青蒿素类衍生物抗肝癌作用机制及联合用药研究进展

楼衷晗 包剑锋

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是严重威胁人类生命健康的疾病，约占原发性肝癌的90%，其死亡率在肿瘤相关死亡病例中位居第三[1]。对于HCC患者，最好的治疗方法是手术切除，然而只有一部分患者适合接受根治性手术，且即使是适合根治性手术的患者，其复发的风险也很高[2]。此外，HCC患者治疗过程中所使用的靶向药和化疗药疗效不佳，不良反应明显，且会面临耐药的窘境，因此大多数 HCC 患者预后较差[3]。青蒿素（artemisinin，ARS）是临床上常用的抗疟药物，目前已陆续开发出了青蒿琥酯（artesunate，ART）、双氢青蒿素（dihydroarteannuin，DHA）、蒿甲醚等多种 ARS 类衍生物[4]，近年来研究发现ARS类衍生物的作用并不局限于治疗疟疾，它还可能对包括癌症在内的其他数种疾病有治疗意义。其中ART和DHA是ARS中活性较强的衍生物[5]，对人HCC细胞有明显的抑制作用，而对非肿瘤正常肝细胞的毒性更低，且不易产生耐药性[6]，具有成为治疗HCC新药物的潜在可能性。因此本文就ARS类衍生物抗HCC作用机制及联合用药研究进展作一综述，为发掘这个经典抗疟疾药在HCC治疗方面的新用途提供思路。

1 ARS类衍生物抗HCC作用机制

ARS类衍生物抑制肿瘤生长的机制尚不完全清楚，其中最有可能的机制是ARS类衍生物以多种特定方式同时表现出几种抗HCC的作用模式。

1.1 活性氧（ROS）簇介导的细胞毒反应 内源性过氧化物（即ARS过氧键）会在游离亚铁（Fe2+）存在的条件下裂解而致ROS的形成，导致氧化应激，引起细胞氧化性损伤，最终使细胞死亡[7]。肿瘤细胞的增殖转移需要大量Fe2+及更高的铁利用率，而正常细胞由于摄铁能力正常则不受影响。与正常细胞相比，高水平的可变铁库（LIP）是肿瘤细胞异常增殖、耐药的重要物质和代谢基础[8-9]，因此推测ARS类衍生物正是利用ROS介导的基本细胞毒反应而达到抗肿瘤的生物活性，ROS和Fe2+增强了ARS对HCC细胞的细胞毒反应。研究发现，ART可以调节多个HCC细胞的LIP，并可有效诱导ROS依赖性的HCC细胞死亡，其机制是ART通过酸化溶酶体促进储铁蛋白的溶酶体降解从而增加了LIP，因此Fe2+在内质网中累积，促进了ROS的过量产生和严重的内质网破坏，从而导致HCC细胞死亡[10]。另有研究结果同样显示ART抗HCC作用机制为其可促进ROS积累的能力，ROS通过氧化脂质、蛋白质和DNA对HCC细胞产生毒性，最终导致细胞损伤或基因组不稳定[11]。

1.2 细胞程序性死亡

1.2.1 诱导细胞凋亡 细胞凋亡为细胞程序性死亡，是细胞死亡的方式之一。一般来说，细胞凋亡的途径可分为内源性途径和外源性途径，内源性途径又称线粒体途径，由氧化应激和DNA损伤触发；外源性途径为受体介导途径，由死亡受体激活启动[12]。介导凋亡的重要因子有B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）家族（促凋亡蛋白 Bax、Bim、Bid、Bak、Noxa等）、抑凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1等）、半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族蛋白（Caspase-8/9/10为启动者，Caspase-3/6/7为执行者）、p53蛋白、细胞色素C以及凋亡蛋白激活因子1基因[13-14]。Zhang等[15]首次发现DHA诱导HCC细胞凋亡依赖于Caspase级联反应（Caspase-3/9），Bcl-2家族蛋白也可通过调节线粒体膜通透性来调控线粒体凋亡诱导因子向细胞质释放（DHA激活Bak），另外抑癌基因p53可能在DHA诱导的细胞凋亡过程中起部分促进作用。Hou等[6]研究证实了p53在细胞凋亡中的促进作用，并发现ART与DHA诱导HCC细胞凋亡是通过激活Caspase-3、增加Bax/Bcl-2比值和多聚二磷酸腺苷-核糖聚合酶含量，进而下调鼠双微粒体-2基因（MDM2）实现的（MDM2被认为是癌症预防和治疗的分子靶标）。然而，另有两项研究发现Caspase-8也参与了DHA诱导的外源性和内源性细胞凋亡途径[16-17]，其中Qin等[17]推断Caspase-8和Caspase-9独立激活了Caspase-3介导DHA诱导的HCC细胞凋亡，此外他们进一步总结了DHA诱导HCC细胞凋亡的信号通路，即DHA诱导的ROS触发了内源性和较小程度上不涉及Bid的外源性细胞凋亡途径，Bim和较小程度的Noxa优先激活Bak的内源性凋亡途径。

1.2.2 非凋亡性细胞死亡 除细胞凋亡外，还有其他程序性死亡方式，如细胞自噬、铁死亡等。目前研究发现细胞自噬的调节主要涉及的信号通路以单磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）及雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路为核心[18]。AMPK可促进细胞自噬发生，而mTOR则抑制自噬发生[19]。重组人丝氨酸-苏氨酸激酶（AKT）-mTOR信号传导是细胞自噬的关键负调节因子，Zou等[20]研究发现DHA可通过抑制AKT-mTOR途径使蛋白轻链3-Ⅱ/蛋白轻链3-Ⅰ比值增加进而诱导HepG2细胞自噬，且该研究推测DHA可能是通过下调端粒保护蛋白重组人三肽基肽酶Ⅰ（TPP1）的表达来发挥抗癌作用的。TPP1的基本功能是阻止毛细血管扩张性共济失调突变和RAD3相关激酶依赖的DNA损伤反应，在正常的细胞功能维持中起着至关重要的作用。Shi等[21]同样认为DHA抑制HePG2细胞是通过细胞自噬介导的，在细胞自噬中，ROS的产生可致细胞核和线粒体DNA损伤，且该研究首次发现DHA能促进黑色素瘤缺乏因子2/Caspase-1炎症体的形成，该机制有助于促进HePG2细胞自噬。

铁死亡是2012年所发现的一种细胞死亡方式[22]。国内有学者发现DHA可诱导HCC细胞内谷胱甘肽含量下降，并能下调铁死亡相关蛋白质谷胱甘肽过氧化物酶4蛋白水平，推测DHA可通过诱导HCC细胞发生铁死亡来抑制其生长[23]。而最新研究发现ART可激活溶酶体功能，并促进HCC细胞中铁蛋白的降解和Fe2+的释放，诱导HCC细胞铁死亡[24]。

1.3 细胞周期阻滞 肿瘤细胞周期的失控使细胞获得了增殖过多的失控性生长特征。细胞周期调控机制的核心是细胞周期依赖性蛋白激酶（CDK）和细胞周期素（cyclin）[25]。研究发现DHA可导致G2/M期阻滞从而显著抑制HCC细胞生长，cyclin-B/细胞分裂周期蛋白2激酶活性的丧失和细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C的下调可能是DHA诱导的G2/M期阻滞的原因之一[15]，因为cyclin B是细胞周期由G2期向M期转化所必需的，它能与CDC2相互作用形成cyclin B/CDC2复合物，称为M期促进因子[26]。Hou等[6]研究发现ART和DHA可能是通过诱导细胞周期阻滞于G1期从而来抑制HCC细胞增殖，两种药物均能降低cyclin D1/E和CDK4/E2启动结合因子1水平且上调周期素依赖激酶相互作用蛋白-1/p21和激酶抑制蛋白-1/p27水平。另一项研究也发现ART使HCC细胞周期阻滞在G1期，但其机制是通过与细胞代谢相互作用来调节YAP Ser127的磷酸化和胞浆滞留，来抑制HCC细胞的增殖[27]。

值得注意的是，Ilamathi等[28]研究首次发现IL-6-酪氨酸蛋白激酶-信号转导和转录激活因子（JAKSTAT）这一负反馈机制，观察到ART是通过细胞信号转导抑制因子3促进了负反馈环抑制机制，从而抑制了JAK-STAT信号最终达到抑制HCC细胞增殖目的。

1.4 抑制肿瘤血管生成、侵袭和转移 肿瘤血管生成、侵袭和转移是癌细胞扩散的主要方法。上皮向间充质转化（EMT）是癌细胞失去上皮极性成为间质样细胞的过程，被认为是癌症进展过程中的始动因素[29]。Jing等[30]认为长链非编码RNA（lncRNA）在HCC细胞的EMT中起着关键作用，进一步研究发现ART是通过阻断HCC细胞中的lncRNA RP11/果蝇MAD基因3哺乳动物类似基因3轴来抑制EMT，从而抑制HCC细胞侵袭、转移。基质金属蛋白酶（MMP）和基质金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP）在肿瘤的侵袭、转移过程中担任了重要角色，也是肿瘤血管生成和抑制的重要因子。Tan等[31]研究发现ART可通过降低MMP-2和诱导TIMP2蛋白表达来抑制HCC细胞体内外的侵袭和转移；此外，ART可激活Cdc42增强钙黏蛋白E（E-cadherin）的活性，从而改善细胞与细胞间的黏附状态，显著抑制HCC细胞转移。另有学者同样认为上调E-cadherin蛋白活性对DHA抑制HCC细胞侵袭、转移至关重要，但其机制是通过下调表皮生长因子受体及其下游信号通路磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、磷酸化 EPK、N-cadherin、Snail、Slug 蛋白表达水平来实现的[32]。DHA还可通过磷酸肌醇3-激酶（PI3K）/AKT信号通路在体内和体外下调纤连蛋白-1和β1-整合素来抑制HCC-LM6细胞的迁移和转移[33]。也有学者认为ART是通过调节N-cadherin-Snail-E-cadherin轴来抑制细胞迁移和侵袭的[27]。

肿瘤血管生成是由血管生成因子和血管抑制因子的失衡所致，指血管处于持续生长、重塑状态中，最终形成畸变血管。有研究发现对于HCC，ART在体外和体内均能降低血管内皮生长因子（VEGF）和胎盘生长因子表达，VEGF是目前已知最重要的促血管生成因子，且ART在小鼠模型中可抑制肿瘤血管生成，其机制可能依赖于未折叠蛋白反应，但他们未对上游机制作进一步研究[34]。

2 ARS类衍生物联合用药

联合用药可相互增强治疗效果、预防耐药性发生、减少每单次治疗使用的剂量以及减少化疗药物和分子靶向药的不良反应。

2.1 ARS类衍生物联合分子靶向药 索拉菲尼（SORA）是一种多靶点酪氨酸激酶抑制剂，具有双重抑制、多靶点阻断的抗HCC特点，是目前治疗晚期HCC的一线用药。但SORA的临床疗效很大程度上受到耐药和不良反应的限制[35]。其耐药机制可能包括EMT、PI3/AKT和JAK/STAT通路失调、低氧诱导反应和代谢重编程等[36]。因此针对联合用药提高SORA疗效、增敏和逆转耐药的研究是十分必要的，ARS类衍生物对此有很大潜力。有学者提出ART与SORA的协同作用包括诱导细胞凋亡、抑制细胞迁移和抗血管生成活性，其中在诱导细胞凋亡和抑制迁移两方面固定药物浓度比例的联合用药表现出相互增强的作用[37]。另有动物实验表明SORA与ART联合用药可致小鼠肿瘤生长抑制效果均显著优于两者单独用药，而其协同抗HCC机制是通过调节细胞外调节蛋白激酶（ERK）和STAT3信号转导实现的[11]。而有其他学者认为铁死亡才是SORA与ART联合用药协同作用的机制，而非细胞凋亡、坏死等，ART和小剂量SORA在体内外诱导HCC铁死亡具有双重作用机制即ART诱导的溶酶体激活和SORA诱导的氧化应激[24]。

先前有研究表明，在长期单一使用SORA治疗的患者中，其耐药性与组成PI3K/AKT/mTOR通路的高表达酶有关[38]。后续有学者发现SORA联合ART治疗可刺激丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶/丝裂原活化蛋白激酶和PI3K/AKT/mTOR信号通路，这是一种促进细胞凋亡的双重抑制作用[39]，与上述认为铁死亡机制的研究不同。Hou等[40]发现DHA可能通过降低多肽-N乙酰氨基半乳糖转移酶10的表达来增强SORA抗HCC作用，并其可进一步通过影响O-糖基化和PI3K/AKT信号转导途径直接参与抗HCC的作用。最新一项研究还显示，轴突生长抑制蛋白B受体（NGBR）可通过激活丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶通路产生SORA的耐药性，ART则可通过抑制NGBR来增加HCC细胞对SORA的敏感性[41]。综上所述，ARS类衍生物可作为一种理想的逆转耐药或增敏剂，在低于毒性阈值的剂量下提高对SORA耐药HCC的疗效。

2.2 ARS类衍生物联合化疗药物 临床上可有效治疗HCC的化疗药物并不多，比较常用的药物有阿霉素、顺铂和氟尿嘧啶等。一项研究发现DHA和吉西他滨在体内外联合用药均可更明显抑制HepG2和Hep3B细胞的生长，其疗效优于ART，其机制可能是联合用药增强诱导了细胞凋亡[6]。而另有学者发现DHA可能通过抑制 p53（R248Q）-ERK1/2-NF-κB信号通路而降低P糖蛋白的表达，最终使p53（R248Q）表达的HCC细胞对阿霉素产生增敏效果[42]。

3 结语与展望

ART和DHA作为经典抗疟疾药物，具有明显的抗HCC活性，而其与分子靶向药或化疗药物联合使用，可在体内和体外提高肿瘤细胞杀伤率，且对药物增敏及逆转肿瘤耐药方面也有积极作用。总体而言，不管是ARS药物单独用药，还是联合用药的协同作用，其潜在机制是相类似的，即抗肿瘤血管生成、侵袭或转移、细胞周期阻滞、ROS累积、调节特定信号转导途径、诱导细胞凋亡、自噬及铁死亡等，可能会以多种特定方式发挥作用，同时表现出几种抗HCC的作用模式。ARS类衍生物具有高效、低毒、耐受性好、价格低廉等优点，但也存在着生物利用率低、半衰期短、水溶性差等缺点，不过当前可利用纳米脂质体、金属化合物等新型材料对ARS类衍生物进行结构修饰从而弥补这些短板。但目前有关于ARS类衍生物治疗HCC的临床研究较少，仍需多进行对照、双盲、随机的临床试验，以测试ARS类衍生物单独或联合用药治疗HCC的有效性和耐受性。