炎性细胞因子在肌萎缩侧索硬化诊断治疗中的研究进展

李晓光，杨 璐，刘旭东，贾鑫淼，程燕飞，3，崔丽英

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 1.神经内科； 2.医学科学研究中心，北京 100730；3.山西医科大学 第七临床医学院 临汾市人民医院 神经内科, 山东 临汾 041000)

肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一组选择性累及脑和脊髓运动神经元的致死性神经系统变性病，机制不明，尚无有效治疗。遗传因素在ALS的发生发展中起重要作用， 目前认为ALS是多基因参与的复杂疾病，迄今已发现超过30个致病基因。有基因突变的患者和无基因突变的患者临床表现，如肌萎缩及肌无力部位，进展速度等差别不大，发病年龄稍低。各种基因突变及无突变的病例涉及多种病理机制，包括内质网应激、线粒体功能异常、氧化应激、蛋白的错误折叠聚合和钙超载、RNA/DNA调控异常及炎性反应等。其中小胶质细胞与星形胶质细胞介导的神经炎性反应在ALS运动神经元变性中的作用成为近年来研究热点[1]。

ALS患者脑脊液和血液多种炎性细胞因子水平发生改变，支持神经炎性反应在导致进行性运动神经元丢失的致病机制中的作用，也提示其可能成为有助于ALS诊断、预后判断的潜在特异性生物标志物及潜在的治疗靶点。有研究发现，少数单个炎性细胞因子不具有足够的敏感性和特异性作为特异性指标，需要结合其他指标[2]，也无治疗成功的临床试验。因此，阐明各类型ALS中多种炎性细胞因子变化的规律，具有重要的临床意义。本综述介绍了ALS中相关炎性细胞因子研究的进展，并对文献中报道的结果进行了分析，以期对今后的相关研究有所启发。

1 神经炎性反应是肌萎缩侧索硬化重要的病理机制

ALS患者的免疫系统失调导致中枢和外周炎性反应增加。神经炎性反应的特征是小胶质细胞激活、星形胶质细胞增生、T淋巴细胞和单核细胞浸润以及炎性细胞因子的过度产生。小胶质细胞激活后分为MI型和M2型。M1型促进神经毒性T细胞反应，分泌活性氧和促炎因子,包括白介素-1(interleukin-1，IL-1)、IL-6和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)，以及减少保护性神经营养因子的分泌而具有细胞毒性。相反，M2型具有保护作用，可释放高水平的抗感染细胞因子和神经营养因子，包括IL-4、IL-10和胰岛素样生长因子(insulin like growth factor，IGF)以及与其他神经保护信号分子。

目前普遍认为ALS患者血液中的淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞等免疫细胞通过白细胞介素、趋化因子、细胞黏附分子及受体等一系列分子之间的相互作用，可穿过血脑屏障并进一步破坏血脑屏障，进入中枢神经系统，导致脑脊液的改变及中枢神经系统炎性反应[3]。

在ALS患者体内发现单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)，嗜酸粒细胞衍生神经毒素、嗜酸粒细胞趋化因子、C反应蛋白、TNFα等均有升髙，包括许多白细胞介素在内的大量炎性细胞因子和免疫细胞(如T调节细胞，Treg)和更快或更慢的进展相关[4]。这为进一步在更多患者及更细分组情况下确定其变化规律提供了坚实的数据。

2 肌萎缩侧索硬化基因变异与炎性机制

对炎性过程研究有望将不同基因突变所致的ALS联系起来，为ALS神经功能障碍和运动神经元退化的共同机制提供线索，可能加快对患者生物标志物的确定及治疗干预途径和靶点的确定。从1993年起已发现了数种导致ALS的突变基因。有些突变基因编码的许多蛋白质可损害免疫系统功能，提供了免疫失调参与ALS发病机制的重要证据[5]。超氧化物歧化酶1(SOD1)、TAR-DNA结合蛋白(TAR-DNA binding protein，TARDBP)或C9orf72突变转基因啮齿动物模型及ALS患者出现中枢神经系统内的明显炎性反应，这些突变基因的表达导致ALS样病理改变及免疫功能障碍。编码视神经素蛋白(optineurin，OPTN)、编码丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶结合激酶1(TANK-binding kinase 1，TBK1)、编码序列体1蛋白(sequestosome，SQSTM1，也称为泛素结合蛋白p62)、编码肿瘤坏死因子α诱导蛋白3相互作用蛋白1(TNF-α-induced protein 3-interacting proteins，TNIP1)、编码含缬氨酸蛋白(valosin-containing protein，VCP)基因和编码趋化因子受体1[chemokine (C-X3-C motif) receptor 1，CX3CR1]的基因等也有报道可直接损害免疫基因功能并促进炎性反应。这些突变基因是中枢神经系统和外周免疫系统驱动的炎性机制参与ALS发病机制的最直接证据。也提示自噬、核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)和下游核苷酸结合域样受体蛋白3(NLR pyrin domain-containing protein3，NLRP3)炎性小体参与了ALS的发病机制。

OPTN基因是目前唯一被认为通过功能丧失突变导致经典ALS的已知基因。OPTN通常抑制NF-κB活性，NF-κB是先天性免疫反应的一个关键组成部分，在其缺失或突变形式下，NF-κB被转移到细胞核，并促进大量促炎基因的表达，从而增强小胶质细胞介导的神经炎性反应。大多数研究认为突变的OPTN与NF-κB通路的失调有关，从而促进促炎性反应。OPTN基因也通过促进周围免疫细胞中TBK1激活和干扰素(interferon)释放调节炎性反应信号。因此OPTN/TBK1介导的IFN-轴调节失常导致受损神经元内免疫衰竭，易感于神经元退行性病变[6]。

TBK1基因无义及错义突变可引起家族及散发性ALS和额颞痴呆，TBK1基因共分离和单倍体不足突变也会导致ALS和额颞痴呆[7]。TBK1蛋白结合并促使许多蛋白质磷酸化，包括OPTN和sequestosome-1/p62，并调节先天固有免疫和自噬。TBK1功能域的错义突变可损害正常靶点的结合和磷酸化，提示功能缺失机制和截短突变类似[8]。

ALS患者有数种SQSTM1基因突变。SQSTM1基因编码一种调节自噬和氧化应激的主要病理蛋白p62。SQSTM1的突变可改变p62的功能，并通过损害聚集蛋白降解和自噬而促进ALS的病理生理学[9]。

VCP基因突变可导致家族性和散发性ALS。VCP是自噬和ALS泛素化蛋白酶体途径的重要组成部分。VCP突变损害整体蛋白质降解并导致TDP43沉积，导致包涵体肌病、Paget病、额颞痴呆和ALS[10]。

不同基因突变的ALS患者相关炎性细胞因子表达不同，SOD1基因突变ALS患者组从发病到死亡的时间长于C9orf72六核苷酸重复序列扩增ALS患者组和其他ALS患者组。其他ALS患者组脑脊液TNF-α高于C9orf72六核苷酸重复序列扩增ALS患者组。与其他ALS患者组和SOD1基因突变患者组相比，C9orf72六核苷酸重复序列扩增患者组的脑脊液IFN-α水平更高。ALS患者的生存率与IL-10呈负相关。其他ALS患者组血浆TNF-α、IL-10和TNF相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)，C9orf72六核苷酸重复序列扩增患者组血浆IL-1β，SOD1基因突变ALS患者组脑脊液TRAIL均与生存率呈负相关[11]。这一研究进一步证实ALS各亚型的生存时间差异与细胞因子水平相关，表明不同ALS基因变异存在相关的特异性免疫反应。

3 炎性细胞因子做为临床诊断、分型及预后生物标志物的研究

目前在ALS患者中检测各种炎性细胞因子的研究较多，但结果差异较大。如肌酸激酶、铁蛋白、TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-8、IL-12p70、IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等水平普遍升高，而IFN-γ降低，认为ALS存在T细胞介导系统性调节的炎性标志物，结合各种变量综合考虑，IL-6、TNF-α和IFN-g是调节幅度最大的标志物。转铁蛋白和IL-2高水平是短生存期的预测因子。IL-5水平与肌酸激酶成正相关，而TNF-α与神经微丝轻链(neurofilament light，NfL)成正相关。IL-6与C反应蛋白水平相关，在纵向观察中显示在患者终末期水平增加。在进展缓慢的ALS患者、男性患者、肢体起病、功能损害较小的ALS患者以及使用利鲁唑治疗的ALS患者中，血浆IL-6在6次就诊中逐渐增加，表明IL-6在患者分层中可能有一定作用[4]。也发现ALS患者和对照组IL-4、IL-1b和IFN-γ水平存在显著差异，ALS患者IL-4和IL-1b水平升高，而健康对照组的IFN-γ水平较高[12]。IL-6水平可区分ALS患者和正常对照，并可做为ALS诊断的生物标志物，IL-2水平的升高在ALS起保护作用[13]。而IL-6水平与年龄及呼吸功能有关，认为与疾病的炎性反应状态无关[14]，有时ALS患者和对照组脑脊液和血液IL-6水平无差别，而TNF-α升高[15]。也发现TNF-α在ALS患者脑脊液和血液均升高[16]。脑脊液MCP-1、MIP-1a和IL-18以及血浆MCP-1和IL-18有可能是ALS患者存在炎性的标志物，神经微丝(neurofilaments，NFs)在ALS患者也升高，随病程变化趋于稳定，可预测疾病进展速度和生存率[17]。这意味着这类炎性标志物可以预测预后。

ALS患者脑脊液IL-6水平高于健康对照组和神经疾病对照组。ALS患者血清IL-6水平与健康对照组相比也有所升高，但与神经疾病对照组相比无显著性差异。他们在所有患者均可观察到血清IL-6R增加，只有ALS患者脑脊液IL-6R水平显著升高。根据基因型比较，只有携带IL-6R C等位基因的ALS患者脑脊液IL-6水平升高，携带IL6R C等位基因的ALS患者ALSFRS-R评分下降幅度大于未携带IL-6R C等位基因的患者[18]，并认为这组患者可以进行以IL-6为靶点的治疗[19]。

有此可见，寻找脑脊液和血液中与临床表型相关的炎性细胞因子是研究热点，但集中在少数几个炎性细胞因子，结论不一致，尤其脑脊液与血液检测结果差异较大。临床收集脑脊液需进行有创的腰椎穿刺，限制了临床常规应用。血液中炎性细胞因子水平受影响因素多，ALS患者血液中某些细胞因子的水平在第一次和第二次就诊之间变化很大，甚至在某些情况下与健康对照组没有差异，显示出疾病的巨大异质性。前期研究主要的问题是样本量较小，无法对患者进行发病部位、年龄及临床分型及分期的亚组分析。

4 炎性细胞因子做为治疗监测指标的研究

在临床药物试验中可利用炎性因子作为监测治疗反应的生物标志物及治疗靶点。ALS患者的炎性反应是一个复杂过程，因此旨在降低炎性标志物丰度的治疗有一定意义。

早期研究联合使用阿纳金拉和利鲁唑治疗中度进展的ALS和下运动神经元病患者，未观察到对疾病进展的影响。患者血清IL-6和TNF-α有轻微下降。而纤维蛋白原水平显著降低，血清中的C反应蛋白水平升高，表明这种药物组合可能针对特定的炎性反应途径[20]。

托珠单抗(tocilizumab)是一种基于抗体的治疗药物，可抑制IL-6和可溶性IL-6信号，已证明可降低治疗24 h后散发性ALS患者外周血以及与活化巨噬细胞共培养的单核细胞中炎性介质的mRNA表达和蛋白分泌。向患者直接输注托珠单抗可降低急性和纵向基础炎性反应程度较高的散发性ALS患者血清许多炎性细胞因子的mRNA表达，并与ALSFRS-R评分的降低程度相关[21]。

由巴利昔单抗(basiliximab)、他克莫司(tacrolimus)、霉酚酸酯(mycophenolate)和强的松组合的免疫抑制方案治疗31个ALS患者6个月时ALSFRS-R无改善。但IL-2水平升高，在随访中逐渐下降[22]。

在低剂量IL-2每4周治疗5 d为一个循环的临床试验中发现主要终点结局在第一循环治疗后患者调节性T细胞 (regulatory T-cell，Treg)百分比显著升高，次要结局在5个循环治疗后Treg百分比依然与对照组有显著差异，值得进一步评估减缓ALS疾病进展的效果[23]。

从治疗角度，预后不良和病情进展缓慢的ALS患者从某一种治疗中获益程度是不同的。确定炎性细胞因子的水平与临床表型，病程的关系是非常重要的，因为即使在无法改变致病基因突变直接结果的情况下，炎性过程可能成为分层指标及治疗干预的靶点，或对疾病预后有一定预测作用。

5 问题与展望

ALS是一种多因素、多基因参与的疾病，不同的病理机制直接或间接导致运动神经元变性，神经炎性反应是这些机制之一。多项研究表明，ALS患者的神经炎性反应状态并不总是相同，ALS患者中细胞因子水平及变化趋势因疾病阶段、ALS类型、患者全身状态具有较大异质性。识别特定的细胞因子以帮助诊断、预测疾病的进展及候选靶点具有挑战性。因此，应进一步研究ALS疾病进展过程中各种促炎和抗炎细胞因子的变化规律，了解其时间点激活及其与ALS中其他分子和临床表现的关系，有助于根据ALS患者的炎性反应状态进一步分层，从而更好地监测疾病进展，并且开发针对这些关键免疫因子的更准确的治疗方法。