m6A甲基化修饰参与成骨分化调控的研究进展

张校晨，孙唯夫，方世殊，秦 文，金作林

环境对DNA序列中遗传信息突变的影响使得细胞可以继承和传递不属于基因组序列的信息[1]。RNA修饰是这些超越传统遗传模式的表观遗传的重要组成部分[2]。其中N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)修饰在真核生物中最为普遍，广泛存在于核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)、核小RNA(snRNA)、微小RNA(miRNA)和长链非编码RNA(lncRNA)[3-5]。近年来研究发现，m6A修饰在代谢性疾病调控方面[6]，特别是在骨质疏松中担任重要角色[7]。然而，m6A修饰在成骨分化中的具体机制目前尚无充分的证据且存在争议。以下就m6A修饰机制及几种典型相关蛋白与成骨分化关系作一综述。

1 m6A甲基化修饰机制

m6A甲基化过程通过m6A甲基转移酶(writers)催化并由m6A去甲基酶(erasers)动态逆转，再由m6A结合蛋白(readers)识别后调节RNA的加工代谢及后续生物学效应。

1.1 writers参与m6A编写过程

writers核心成分是甲基转移酶样3(methyltransferase like 3，METTL3)和METTL14(methyltransferase like 14，METTL14)组成的异二聚体复合物，其他亚基起协同作用[8]。核心催化位点METTL3具有与S-腺苷甲硫氨酸(SAM)结合的区域和保守的DPPW基序[9]。METTL14本身不具有催化酶的功能，但可以提供一个结合支架辅助增强METTL3作用[10]。肾母细胞瘤关联蛋白1(Wilms′ tumor-associated protein 1，WTAP)作为第三个重要亚基引导复合体定位于核斑点维持催化活性[11]。此外，病毒样m6A甲基转移酶相关蛋白(vir like m6A methyltransferase associated，VIRMA)能够招募修饰位点区域的mRNA优先甲基化[12]。锌指结构蛋白13(zinc finger CCCH domain-containing protein 13, ZC3H13)能够与RNA结合基序蛋白15(RNA-binding motif protein 15，RBM15)/RBM15B结合并将其连接到WTAP上，同时引导ZC3H13-WTAP-Virilizer-Hakai复合物定位[13-14]。其中E3泛素连接酶Hakai属于保守组分，其泛素化是异二聚体结构形成所必需的[15]。METTL16(methyltransferase like 16，METTL16)主要作用在3′-UTR，敲除METTL16可导致m6A的甲基化减少约20%[16]。

1.2 erasers参与m6A擦除过程

目前发现有两种erasers：脂肪量和肥胖相关蛋白(fat mass and obesity associated protein, FTO)和AlkB同源物5(AlkB homolog 5, ALKBH5)。FTO将m6A氧化成N6羟甲基腺苷(N6-hydroxymethyl adenosine, Hm6A)及6-甲酰基腺苷(6-formyl adenosine, F6A)。这两个不稳定的中间体通过释放甲醛和甲酸还原为腺苷[17]。ALKBH5可以直接催化m6A使甲醛迅速释放[18]。有研究发现含m6A的RNA可能是FTO最有利的碱基底物[19]。然而Mauer等[20]发现FTO对m6A的作用似乎是有限的，FTO优先使N6, 2′-氧-二甲基腺苷(N6,2′-O-dimethyladenosine, m6Am)而不是m6A脱甲基。相反ALKBH5对m6A具有高度的特异性而对m6Am没有活性，迄今为止也没有发现ALKBH5作用的其他底物。

1.3 readers参与m6A读取过程

readers读取方式可以分为三种模式。主要的作用方式是直接结合m6A位点。YTH结构域家族(YTH domain family，YTHDF)均在细胞质中发挥作用，YTHDF1促进mRNA的翻译效率[21]。而YTHDF2导致mRNA从翻译区迁移到衰变位点(如P体)加速降解[22]。但YTHDF3可能在mRNA衰变之前先与其结合并协同YTHDF1作用[23]。细胞核成员YTH结构域包含蛋白(YTH domain-containing proteins，YTHDC)也可以直接结合m6A，YTHDC1促进SRSF3结合并抑制SRSF10结合调控mRNA的剪切[24]，而YTHDC2选择性地结合m6A的共有基序，增强mRNA翻译效率，但也会降低其mRNA含量[25]。真核生物转录起始因子3(eukaryotic initiation factor 3，EIF3)[26]和核糖体(ribosomes)[27]对mRNA的翻译过程有一定影响。胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding proteins, IGF2BPs)能够以弱亲和力结合m6A促进mRNA的稳定性[28]。

另外一种方式是间接结合m6A位点，即“m6A开关”[29]，意思是m6A-U对比A-U脆弱使得RNA更容易形成简单线性的未折叠结构从而更容易招募蛋白。人异质性细胞核核糖蛋白C(human heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C，HNRNPC)[29]和人异质性细胞核核糖蛋白G(human heterogeneous nuclear ribonucleoprotein G，HNRNPG)[30]就是通过这种方式影响mRNA的剪切。HNRNPA2/B1调控mRNA成熟、转运和代谢以及lncRNA的基因调控[31]。GTP酶激活蛋白-结合蛋白(GTPase-activating protein-binding proteins, G3BPs)是一种被m6A排斥的蛋白，正向调节mRNA的稳定性[32]。

最后一种方式是与直接结合蛋白发生结合。脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein, FMRP)以不依赖RNA的方式与YTHDF2相互作用，逆转降解以维持稳定性[33]。

2 m6A甲基化修饰参与成骨分化调控

2.1 writers与成骨分化

METTL3可以通过以下途径促进成骨分化功能:①选择性剪切，METTL3抑制血管内皮细胞生长因子A(VEGFA)剪切，促进成骨细胞的成熟[34];②翻译效率，METTL3促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)中甲状旁腺激素1受体(parathyroid hormone 1 receptor, PTH1R)mRNA的蛋白质合成，增强甲状旁腺激素(PTH)诱导的成骨反应[35]；③与YTHDF2协同调节mRNA稳定性，YTHDF2与METTL3诱导的甲基化pre-miR-320结合并促进降解，增强BMSCs成骨分化[36]。有趣的是，METTL3对于一些其他来源细胞会产生相反的作用。METTL3促进MYD88RNA甲基化及表达量，增强NF-κB信号通路抑制月经血来源间充质干细胞(menstrual blood-derived mesenchymal stem cells, MenSCs)成骨分化[37]，同时可以启动破骨细胞骨吸收功能[38]。

目前对于METTL14促进成骨作用的研究结论较为一致，可以直接增强成骨相关转录本Klotho的m6A水平导致其降解，促进人血管平滑肌细胞(HASMC)骨化并降低血管修复功能[39]。还可以增强微处理器蛋白DGCR8对pri-miR-103-3p的识别，负向调节miR-103-3p成熟，间接逆转功能上的抑制成骨细胞活性[40]。

2.2 erasers与成骨分化

erasers通过调控mRNA稳定性影响成骨分化。但是也有积极、消极两方面作用。FTO通过Hspa1a-NF-κB信号轴增强mRNA稳定性，保护成骨细胞免受基因毒性物质(UV和H2O2)损伤[41]。另外，在人股骨头MSCs样本中FTO介导过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, Pparg)mRNA去甲基化，并以依赖于YTHDF1的方式降低其稳定性，促进BMSCs成骨分化[42]。但是，Shen等在小鼠BMSCs体外实验中发现FTO使Pparg mRNA去甲基化进而表达量增加，促进BMSCs向脂肪细胞分化而不是成骨细胞分化[43]，可见不同物种的反应也是不同的。而同样矛盾的结果在另一项人BMSCs的体外实验中也被发现，即FTO过表达降低成骨相关因子Runx2 mRNA的表达水平，抑制成骨分化[44]。可见FTO确切机制还有待更广泛研究证实。

ALKBH5似乎可以充当METTL3抑制成骨作用的拮抗剂[37-38]，还可以使BMP2 脱甲基并激活AKT信号通路促进黄韧带骨化(ossification of the ligamentum flavum, OLF)[45]。体外下调ALKBH5后，大鼠颅骨成骨细胞分化和矿化减少是由于Runx2 mRNA稳定性降低所致[46]。然而体内实验却有不同的结果，Li等在条件敲除ALKBH5的小鼠股骨中观察到骨密度显著增加，进一步研究发现ALKBH5通过增加PRMT6 mRNA衰减率，抑制骨发育过程中PI3K/AKT通路的激活，从而负向调节人BMSCs的成骨分化[47]。这种矛盾作用可能与研究细胞所处的复杂体内环境有密切关系。

2.3 readers与成骨分化

readers直接参与成骨过程的研究较少。低表达YTHDF2可以增强LPS诱导的炎症因子(IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-12)的表达水平，加重炎症和骨质疏松[48-49]。文俊儒等[50]研究也发现敲除YTHDC2可以促进人BMSCs的成骨分化而抑制成脂分化。

3 小结与展望

m6A引起人们的兴趣，不仅因为它参与调节各种生物学过程(基因表达控制、mRNA的稳定性和动态平衡等)，而且在疾病的病因研究、诊断防治中也发挥着重要作用。MSCs因其成骨分化潜能被视为骨修复和骨再生的种子细胞，而m6A在骨骼生物学中充当的关键角色使其成为再生医学、骨组织工程和骨相关疾病防治中的一个很有前途的靶点。然而，m6A与成骨分化相关性研究仍有许多功能调控问题需要进一步探讨。首先，目前对几个关键m6A相关蛋白(METTL3/FTO)研究比较深入，而其他亚基的研究较少，不同组分之间的相互作用也有很大的探索空间。其次，m6A与成骨的关系存在矛盾。实验中使用不同类型的细胞、调控过程中不同动态阶段的影响以及测序方法的差异可能导致结果不同，规范升级检测方法和加强合作交流是必要的。最后，基于m6A成骨功能的药物应用研究几乎没有，期望从成熟的体外细胞实验向体内实验过渡，为相关疾病的防治尽早提供新策略。