川西獐牙菜MYB基因的克隆及生物学信息分析

杜梦卿，普珍，向蓓蓓

（天津中医药大学，天津 301617）

川西獐牙菜（Swertia mussotii）为一年生草本龙胆科被子植物，是常用藏药材“桑蒂”的原植物之一[1]。在临床中广泛应用于急性黄疸型肝炎、胆囊炎、病毒性肝炎、水肿、流行性感冒、痢疾等多种疾病的治疗，是治疗肝胆疾病的良药，有清热解毒、清肝利胆之功效[2-3]。川西獐牙菜的主要化学成分为萜类、三萜类、环烯醚萜类等[4-5]，其主要有效成分獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷等均属于环烯醚萜类化合物[6]。此外，石峥等[7]研究表明，川西獐牙菜的化学成分具有抗肿瘤的生物活性。

MYB转录因子是指含有MYB结构域的一类转录因子，广泛存在于真核生物中，是植物中最大的转录因子家族之一[8-9]。有研究表明，MYB类转录因子广泛分布于植物中，几乎参与了植物生长和代谢的每个方面[10]。通过调控下游基因的转录，MYB转录因子在植物中广泛参与了初生和次生代谢、细胞分化、细胞发育过程以及响应胁迫的信号传导过程[11]，在植物对非生物胁迫的响应过程中起重要调控作用[12]。

1987年，Paz-Ares首次在玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[11]。有研究表明，MYB参与调控花青素等黄酮类化合物的次生代谢，如玉米叶、花、种子中的花青素的合成含量受MYBCl调控，苹果MdMYB9和MdMYB11通过与花青素合成酶、花青素还原酶和无色花青素还原酶的启动子结合，调控花青素和原花青素的积累，拟南芥、龙胆中的MYB转录因子也可以调控黄酮类成分的积累[13-14]。近年来，对川西獐牙菜转录组的研究主要为MK（SmMk），而川西獐牙菜中MYB转录因子相关研究还未见报道。

本研究从川西獐牙菜幼叶中克隆MYB基因序列并对其进行生物信息学分析，为川西獐牙菜中萜类化合物的合成和改良等提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

青海省玉树县采集野生川西獐牙菜的种子，经青海大学董汇泽教授鉴定，试验材料是在温室条件下培养的川西獐牙菜幼叶。

大肠杆菌Rosetta和Escherichia coliTrans 5α菌种购于北京全式金生物技术股份有限公司，用于配置大肠杆菌LB液体培养基。

1.2 试剂与仪器

Eastep Super总RNA提取试剂盒，普洛麦格（北京）生物技术有限公司；卡那霉素，北京鼎国昌盛生物技术有限公司；Reverse Transcriptase M-MLV （RNase H-）试剂盒、Taq DNA聚合酶、10×PCR Buffer、dNTP，大连宝生物工程有限公司；5×T4 Ligase Buffer、TransStart Fast Pfu Fly DNA Polymerase、pEASY-Blunt Simple Cloning Kit、5×TransStart Fast Pfu Fly Buffer、DL2000 plus（2K plus）DNA marker，北京全式金生物技术股份有限公司；快速琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒、高纯度质粒小提试剂盒，康为世纪生物科技股份有限公司；引物合成和基因测序，深圳华大基因科技有限公司。

SW-CJ-1FD超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；HNT-2102C恒温培养振荡器，天津欧诺仪器股份有限公司；DYY-8C琼脂糖凝胶电泳仪，北京六一生物科技有限公司 ；Alpha-1860A紫外分光光度计，上海谱元仪器有限公司 ；TGL-16M高速台式冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；A200 PCR仪，杭州朗基科学仪器有限公司；HVE-50高压蒸汽灭菌锅，广州深华生物技术有限公司。

1.3 方法

根据川西獐牙菜转录组数据所获得的MYB基因的序列和pEASY克隆载体pEASY-BluntCloning Vector的多克隆位点，设计一对引物为cDNA模板，序列如表1所示。

表1 引物序列表

对獐牙菜MYB基因进行PCR扩增，PCR反应体系总体积为 50 μL，含有 dNTP（2.5 mmol/L）4.5 μL，双蒸馏水 24.5 μL，5×TransStart Fast Pfu Fly Buffer 10 μL，川西獐牙菜 cDNA模板2 μL，Pfu DNA聚合酶（50 U/μL）3 μL，上游引物（10 μmol/L）3 μL，下游引物（10 μmol/L）3 μL。PCR的反应流程为：94 ℃变性7 min，94 ℃保护变性30 s，60 ℃引物模板退火完成30 s，72 ℃延伸并合成DNA 90 s，进行30个循环，结束后再72 ℃延伸10 min确保延伸完整。之后将其在4 ℃下进行储存，为电泳法检测PCR产物做准备。

2 结果与分析

2.1 川西獐牙菜MYB基因的开放阅读框（ORF）的克隆

根据得到的转录组信息设计特异性引物，以獐牙菜总RNA逆转录获得的cDNA为模板，利用PCR技术进行扩增，得到一条清晰的1 158 bp的全长序列，推测编码385个氨基酸，和预期大小符合。

2.2 理化性质分析

利用 ExPASy Proteomics tool（https://www.expasy.org/）在线工具进行MYB蛋白氨基酸的理化性质分析，得到MYB蛋白的分子式为C1841H2857N537O593S15，相对分子质量为42 482.08 Da，等电点为6.02，带正电氨基酸残基（Arg+Lys）为39，带负电氨基酸残基（Asp+Glu）为46，不稳定系数为50.04，说明该类蛋白不稳定。脂溶性系数为65.12，亲水性系数为-0.688，说明该类蛋白属于亲水性蛋白质。

2.3 MYB蛋白亚细胞定位预测及信号肽的预测

使用在线软件SignalP-3.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-3.0）在线工具分析出了信号肽的各项值，结果如图1所示。原始切割位点（C）评分为0.039，信号肽（S）评分为0.186，联合切割位点（Y）评分为0.025，平均S评分为0.081，D分数（辨别分数）为0.053，表示该蛋白不含剪切位点，没有信号肽。

图1 MYB蛋白信号肽预测分析

使用PSORTⅡ（https://www.genscript.com/psort.html）在线工具推测獐牙菜MYB蛋白的亚细胞定位情况，结果显示该蛋白定位在细胞核中的可能性为95.7%，定位在线粒体的可能性为4.3%。因此，推断MYB蛋白亚细胞定位可能在细胞核中。

2.4 MYB蛋白跨膜区预测

使用在线工具TMHMM（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0） 和NCBI数 据 库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中 BLASTP程 序 对MYB蛋白预测了跨膜区，结果如图2所示。该蛋白的1-385氨基酸位于细胞膜表面，因此可以推出MYB蛋白不具有跨膜区，表明此蛋白可能是非膜结合蛋白，整条多肽链均处于细胞膜外。

图2 MYB蛋白的跨膜区预测

2.5 MYB蛋白多序列比对

使用NCBI数据库中的BLASTP程序和DNAMAN 8.0软件对MYB蛋白进行了多序列比对。该蛋白与三龙胆、芝麻、烟草、小叶蝉、橄榄、南美烟草及黑毛黄耆中的该蛋白都有同源性，其中与三龙胆R2R3蛋白相似性最高，为70.90%；与黑毛黄耆的相似性最低，为62.01%。川西獐牙菜MYB蛋白存在多个保守区域，序列一致性达到71.03%。

2.6 进化树分析

在NCBI数据库中搜索与川西獐牙菜MYB蛋白序列相似性高的7条序列，利用MEGA 7.0软件进行系统发育分析，结果如图3所示。川西獐牙菜MYB蛋白与三龙胆R2R3在同一个分支上，表明两者之间亲缘性较高。

图3 MYB蛋白的进化树分析

3 结论

有研究对白芷MYB蛋白家族进行亚细胞定位预测，有116个MYB蛋白都定位于细胞核中[15]。本试验使用PSORTⅡ在线工具推测该蛋白的亚细胞定位情况，推断川西獐牙菜MYB基因亚细胞定位可能在细胞核中，与前人研究结果一致；有研究表明，藏药多刺绿绒蒿MhMYB3R蛋白没有跨膜结构域，其529个氨基酸残基均位于细胞膜外[16]。番茄SlMYB44蛋白最大疏水性值为1.533，最大亲水性值为-3.411，没有潜在的信号肽和跨膜结构，属于不稳定、亲水性蛋白[17]。这些结果与本文研究一致。

本文基于转录学数据，利用生物信息学手段分析了MYB基因的ORF全长序列，设计特异性引物对该基因进行了克隆。从生物信息分析结果可以看出，MYB基因编码蛋白的分子式为C1841H2857N537O593S15，等电点为6.02，相对分子质量为42 482.08 Da，不稳定系数为50.04，说明该蛋白不稳定；从氨基酸的组成成分看丝氨酸的占比最高（10.9%），而蛋氨酸的占比最少（1.6%）；采用PCR技术克隆的MYB基因ORF框全长为1 158 bp，推测编码385个氨基酸，属于PLN03091超级家族成员，亚细胞可能定位于细胞核；从多重序列对比和系统发育树的结果来看，川西獐牙菜MYB蛋白与三龙胆R2R3蛋白的亲缘性最高。本试验结果为进一步研究该基因的功能及利用基因工程手段提高川西獐牙菜中环烯醚萜类化合物产量提供了理论依据。