苯丁酸钠对紫杉醇诱导小鼠外周神经痛的镇痛作用

戴向荣，李小羿*，殷雷，陈程，江万祥，钟玉婷

（1.兆科药业（广州）有限公司研发中心，广东广州 511462；2.四川格林泰科生物科技有限公司，四川眉山 620020）

紫杉类药物的抗肿瘤作用于1962年被发现，经历长达30年的研究后，于1992年被FDA正式批准用于治疗晚期卵巢癌等多种肿瘤，2009年在中国获批上市。临床中，紫杉类药物可用于多种肿瘤的治疗，是肿瘤化学治疗的基石药物。然而，其在治疗过程中也会带来多种不良反应，化疗致周围神经病变是紫杉类药物的常见不良反应，即使停止紫杉类药物治疗后，紫杉类药物相关周围神经病变仍可能继续恶化，临床试验报道显示紫杉类药物致周围神经病变的发生概率为2%～33%[1]。

苯丁酸钠别名4-苯基丁酸钠盐、4-苯基丁酸钠，是一种组蛋白脱乙酰酶抑制剂。1996年FDA批准苯丁酸钠用于治疗因氨基甲酰磷酸合成酶（CPS）、鸟氨酸氨甲酰基转移酶（OTC）或精氨基琥珀酸合成酶（AS）缺乏而致的慢性尿素循环紊乱而导致的高氨血症。苯丁酸钠是一个前药，并且能迅速代谢成苯乙酸盐。苯乙酸盐是一种代谢活性的化合物，通过乙酰化作用与谷氨酰胺结合形成苯乙酰谷氨酰胺。苯乙酰谷氨酰胺通过肾脏排泄，使过高的血氨水平和血谷氨酸浓度下降。苯丁酸可磷酸化IκB，将NF-κB p50转位到细胞核，或直接乙酰化NF-κB p50。NF-κB p50反激活Bcl-2基因表达，上调的Bcl-2可阻断细胞色素C的释放和随后的Caspase激活，减缓运动神经元的死亡[2]。

ZHU等[3]研究发现4-苯基丁酸可减轻溶血磷脂酸诱导的内层皮质神经毒性，与显著抑制代谢性谷氨酸受体1（mGluR1）的蛋白水平，阻断Homer1/mGluR1通路从内质网释放Ca2+有关。INCEOGLU等[4]证实内质网应激的化学诱导剂总是会导致疼痛行为，而这种行为会被化学伴侣4-苯基丁酸和可溶性环氧化物水解酶抑制剂逆转。以上研究表明苯丁酸钠在神经毒性方面具有保护作用是明确的，但目前研究主要集中在中枢神经系统方面，对于外周神经疼痛的应用研究很少见。外周神经毒性是化疗药物常见的剂量限制性毒性[5]，因此，参考文献[6-10]的内容使用动物模型探索了苯丁酸钠对紫杉类药物相关周围神经病变的防治作用，以期为患者提供一种新的治疗手段。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

紫杉醇注射液（泰素），批号：0J05868，美国Bristol-Myers Squibb公司；苯丁酸钠颗粒（ZK034），批号20190625，兆科药业（广州）有限公司；普瑞巴林胶囊（阳性对照），批号DR0502，辉瑞制药有限公司。

1.1.2 仪器

ZS-CTY足底刺痛系统，北京众实迪创有限公司；37370-001红外热痛测试仪，德国Ugo Basile公司。

1.1.3 实验动物

C57BL/6小鼠，SPF级，18.81～22.04 g，6～8周龄，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物质量合格证号110324210101054415。

1.2 方法

1.2.1 造模方法

通过腹腔注射紫杉醇，分别于1 d、3 d、5 d和7 d注射1次，每次注射4.5 mg/kg，建立化疗引起的小鼠外周神经痛（CIPN）模型，正常对照组动物按同样频率和剂量注射生理盐水。

1.2.2 试验设计

试验设计具体见表1。

表1 实验设计

1.2.3 给药信息

每天给药一次，连续给药30 d，给药第1天开始造模，给药后1 h给予造模制剂。造模当天定义为试验第1天（day 1，D1）。给药前，将用于给药的制剂放置至室温。

1.2.4 实验指标

（1）一般状态观察：所有计划测定的存活试验动物每天观察一次，如果动物出现异常，可增加观察频率。（2）体重：所有计划测定的存活试验动物每周检测2次。（3）机械痛缩足阈值（MWT）：所有计划测定的存活实验动物造模前检测1次，造模后第7 d、14 d、20 d、25 d和30 d（代号D7、D14、D20、D25和D30，下同）各检测一次。检测前动物先放入检测盒连续适应3 d，每天30 min；每次检测时，动物先放入检测盒适应10 min，每只动物连续检测3次取平均值，每次间隔5 min。（4）热痛缩足潜伏期（TWL）：所有计划测定的存活实验动物造模前检测1次，造模后第7 d、14 d、20 d、25 d和30 d各检测一次。检测前动物先放入检测盒连续适应3 d，每天30 min；每次检测时，动物先放入检测盒适应10 min，每只动物连续检测3次取平均值，每次间隔5 min。（5）神经病理形态学观察：动物于造模后第31 d进行解剖，用1%的戊巴比妥钠溶液麻醉小鼠后，腹主动脉放血安乐死小鼠，用trump’s fixative灌注小鼠后，取出小鼠左后腿坐骨神经置于2%的戊二醛固定液中于4 ℃下保存，在透射电镜下观察坐骨神经中有髓神经纤维的髓鞘板层结构。

1.2.5 数据分析

实验数据以均数±标准误（Mean±SEM）描述。正态和方差齐性的多组间比较先采用单因素方差分析，进一步组间多重比较采用Tukey’s HSD检验；不满足正态分布或者方差不齐，采用Kruskal-Wallis H检验（K-W法）进行分析，组间多重比较采用Dunn’s法。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 一般状态观察

适应期结束后，所有动物一般表现均正常，紫杉醇造模后，少部分动物背部和（或）头部出现脱毛现象。给药后，供试品ZK034高剂量组（1.5 g/kg）约1/2的动物出现四肢僵直、体温降低的状态，ZK034中剂量组（1.0 g/kg）少数动物出现体温降低的状态，其余给药组动物未发现异常反应。

2.2 体重

整个试验过程中（图1），正常对照组动物体重呈增长状态，其余各组动物体重整体变化趋势相同，药物干预对动物体重变化无明显影响。

图1 不同试验组动物体重的变化（n=10）

2.3 对小鼠机械痛缩足阈值的影响

如表2所示，在本试验条件下，供试品ZK034三个治疗剂量（0.5 g/kg、1.0 g/kg及1.5 g/kg）均表现出显著抑制紫杉醇引起的小鼠机械痛阈值降低的作用，ZK034高剂量组和中剂量组动物机械痛缩足阈值基本相同，且高于ZK034低剂量组；给药前，各组动物机械痛缩足阈值基本相同，无明显统计学差异（P＞0.05），药物干预后，ZK034高剂量组和中剂量组动物机械痛缩足阈值在首次检测时（D7）显著升高（P＜0.05），且此状态持续到给药30 d（D30）；ZK034低剂量组动物机械痛缩足阈值在第3次检测时（D20）显著升高（P＜0.05），且此状态持续到给药30 d（D30）。

表2 不同试验组动物机械痛缩足阈值的变化（n=10，单位：g）

以上结果提示在本试验条件下，供试品ZK034对于紫杉醇诱导的小鼠外周神经机械痛具有显著的镇痛作用。

2.4 对小鼠光热痛缩足潜伏期的影响

如表3所示，在本试验条件下，供试品ZK034中、高剂量（1.0 g/kg、1.5 g/kg）表现出显著抑制紫杉醇引起的小鼠光热痛缩足潜伏期缩短的作用，ZK034高剂量组和中剂量组动物机械痛缩足阈值基本相同，且高于ZK034低剂量组；给药前，各组动物光热痛缩足潜伏期基本相同（P＞0.05），药物干预后，ZK034高剂量组和中剂量组动物机械痛缩足阈值在第2次检测时（D14）显著升高（P＜0.05），且此状态持续到给药30 d（D30）；ZK034低剂量组动物光热痛缩足潜伏期升高不明显（P＞0.05）。

表3 不同试验组动物光热痛缩足潜伏期的变化（n=10，单位：s）

以上结果提示在本试验条件下，供试品ZK034中、高剂量对于紫杉醇诱导的小鼠外周神经光热痛具有显著的镇痛作用。

2.5 对小鼠坐骨神经超微结构的影响

在透射电镜下观察坐骨神经中有髓神经纤维的髓鞘板层结构，如图2所示。正常对照组小鼠坐骨神经的有髓神经纤维的髓鞘板层结构较紧密，排列均匀，轻微脱髓鞘；注射紫杉醇后的模型对照组小鼠坐骨神经的有髓神经纤维髓鞘板层结构明显非常松散，呈空网状改变，偶见严重病变处呈灶性溶解坏死，甚至髓鞘脱落、轴突断裂。试验剂量下ZK034和普瑞巴林治疗后小鼠的坐骨神经纤维髓鞘板层结构也较松散，有明显脱髓鞘，但较模型对照组轻。

图2 透射电镜下不同试验组动物坐骨神经超微结构的变化

通过对各试验组动物坐骨神经中的有髓神经纤维和髓鞘异常神经纤维计数（每只动物随机选择5张切片，计算每张切片中的有髓神经纤维数量和髓鞘异常神经纤维数量），并进行统计分析，结果如图3所示。正常对照组动物坐骨神经中的异常髓鞘神经纤维占21.4%±5.35%，显著低于模型对照组（41.8%±10.09%，P＜0.05）；ZK034低、中、高剂量组和普瑞巴林组动物坐骨神经中的异常髓鞘神经纤维百分比均低于模型对照组，分别为30.3%±9.38%、30.8%±9.57%、30.5%±7.13%和30.4%±8.68%，虽然ZK034高剂量组小鼠坐骨神经中的异常髓鞘神经纤维百分比低于模型对照组，但其有髓神经的脱髓鞘程度较模型对照组严重，其异常髓鞘的板层结构较模型对照组松散。

图3 不同处理组髓鞘异常神经纤维占比

3 结论

小鼠腹腔注射紫杉醇后，其机械痛缩足阈值和光热痛缩足潜伏期均显著降低，说明本试验成功建立了模拟临床特征的化疗药物诱导的小鼠外周神经痛模型。

供试品ZK034高剂量组（1.5 g/kg）给药后，约1/2的动物出现四肢僵直、体温降低的状态，ZK034中剂量组（1.0 g/kg）给药后，少数动物出现体温降低的状态，其余给药组动物未发现异常反应，提示ZK034高剂量灌胃下可能存在神经系统影响。在欧盟苯基丁酸钠的批准文件[11]显示：在动物药效学试验中，苯乙酸盐和苯丁酸有神经抑制和神经毒性作用，啮齿类动物试验结果也提示苯丁酸钠有潜在的中枢神经系统危害。综合来看，苯丁酸钠在剂量较高时可能存在神经毒性，症状表现以体温下降、嗜睡为主。从苯丁酸钠中、低剂量组的动物表现来看，未出现与高剂量组类似的对神经系统的影响，结合苯丁酸钠已在临床上应用的实际情况，控制苯丁酸钠临床应用不超量仍然是安全的。

3个试验剂量下ZK034能够显著升高小鼠的机械痛缩足阈值，中、高剂量ZK034（1.0 g/kg、1.5 g/kg）能够显著升高小鼠的光热痛缩足潜伏期，表明苯丁酸钠具有良好的镇痛作用，为临床应用提供了有效性支持。相比模型组，供试品ZK034给药后轻微改善了紫杉醇引起的小鼠坐骨神经中有髓神经纤维的脱髓鞘情况（10%），提示可能需要延长给药疗程。苯丁酸钠作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂，体内、外临床前数据表明，苯丁酸钠具有抗增殖、抗血管生成、抗转移、免疫调节和分化特性[12]，与化疗药物联用可能起到协同作用。

综上所述，本研究将为癌症患者化疗药物副作用提供一种新的治疗途径，但仍需要进一步开展临床研究进行确证。