精子DNA碎片对IVF-ET/ICSI患者妊娠结局的影响及其机制*

张慧, 刘玲, 贺育兰, 汤鲜, 李卓敏, 谢巍伟, 廖婷, 李路茜, 贺彩霞, 张先平

南华大学附属娄底医院生殖医学中心(湖南娄底 417099)

据统计，全球约有15%的育龄夫妇存在不孕不育症，其中约有40%～50%的不孕原因与男方因素有关[1-2]。若夫妻间经1年无保护性措施的性生活后，未能使女方自然受孕者即为不育症[3]。目前对于男性生育力的评估主要依靠精液常规分析。但有研究表明，仍有15%的男性不育症患者精液常规分析结果提示正常，而精液常规参数提示异常者却仍能使其配偶自然受孕[4]。另有研究发现，男性生殖细胞对DNA损伤极其敏感，精子DNA损伤是造成男性不育的主要原因之一[5]。精子DNA碎片指数(DNA fragmentation index，DFI)被认为是反映精子DNA完整性的重要指标，其是指在精子发生及成熟过程当中，由于各种原因导致精子DNA完整性被破坏并产生断裂碎片的程度。近年来，精子DFI评估精子内在质量及预测体外受精-胚胎移植/卵胞浆内精子注射(in vitro fertilization and embryo transfer/intracytoplasmic sperm injection，IVF-ET/ICSI)助孕妊娠的研究结果仍存争议[6-7]。本研究旨在探讨精子DFI对IVF-ET/ICSI助孕后受精情况、胚胎发育及妊娠结局的影响，并分析精子DNA碎片产生的可能机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年8月至2021年4月于南华大学附属娄底医院行IVF-ET/ICSI助孕的61周期不孕不育症夫妇。本研究经过南华大学附属娄底医院伦理委员会审批同意[2019-伦审(科研)-044]，所有研究对象均自愿签署知情同意书。纳入标准：(1)符合IVF-ET/ICSI助孕指征的女方盆腔、输卵管因素或男方因素所致不孕不育症患者；(2)女方年龄25～40岁，窦卵泡数(antral follicle count，AFC)≥5枚，基础卵泡刺激素(basal follicle stimulating hormone，bFSH)≤10 mIU/mL，抗苗勒管激素(anti-mullerian hormone，AMH)≥1.2 ng/mL；(3)男方年龄25～50岁；(4)夫妻双方染色体、生殖器官及性功能均正常。排除标准：(1)自然周期取卵助孕者；(2)女方合并Ⅲ～Ⅳ期子宫内膜异位症者；(3)男方为无精子症、冻精解冻或睾丸/附睾穿刺取精者；(4)男方合并睾丸萎缩、生殖道畸形或泌尿生殖系统感染急性期；(5)夫妻双方任何一方合并染色体异常及其他IVF-ET/ICSI助孕禁忌。

1.2 精子DFI检测及实验分组 男方禁欲2～7 d，手淫法取精，严格按照精子DNA碎片检测试剂盒(深圳博锐德生物科技有限公司)说明书检测精子DFI。根据精子DFI值分为对照组(DFI<25%，n=35)和观察组(DFI≥25%，n=26)。精子DFI(%)=(存在精子DNA碎片的精子数/被观察的精子总数)×100%(正常参考值：DFI<25%)。

1.3 卵巢刺激和取卵 根据女方年龄、体重及体质指数(body mass index，BMI)、AMH、AFC及既往卵巢刺激相关病史等拟定卵巢刺激方案进行卵巢刺激。当存在2～3个≥17 mm的主导卵泡、血雌激素(estradiol，E2)水平在每个主导卵泡平均≥200 pg/mL时，当晚予注射人绒毛膜促性腺激素扳机，扳机34～38 h后B超引导下取卵。

1.4 精液标本收集与精液常规分析 男方禁欲2～7 d，取卵当日(oocyte pick-up day，OPU日)手淫法收集精液。待精液样本充分液化后，按照WHO《人类精液检查与处理实验室手册》(第5版)标准行精液常规分析，使用密度梯度离心+上游法进行优化处理。

1.5 Western Blot检测Bcl-2、Caspase-3蛋白表达 提取精子总蛋白，使用蛋白质定量试剂盒(BCA法)测定蛋白浓度，取5 μL蛋白样品行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭，加入一抗于4℃摇床孵育过夜，洗膜，加入二抗常温摇床孵育，洗膜，电化学发光(ECL)法检测，凝胶图像分析。

1.6 授精及体外培养 卵母细胞体外培养2～4 h后进行授精，授精16～18 h观察受精情况，42～44 h观察卵裂情况，66～68 h进行胚胎评分并酌情行囊胚培养或新鲜卵裂胚移植。参考《辅助生殖实验室技术》(第1版)标准进行胚胎评分。

1.7 IVF-ET/ICSI妊娠结局随访 胚胎移植12～14 d测尿HCG及血清β-HCG确定是否生化妊娠。若确定生化妊娠者则在移植26～28 d阴道超声检查，以观察到孕囊确定临床妊娠，临床妊娠者随访持续至胎儿分娩。

1.8 各种计算公式 (1)IVF 2PN受精率(%)= 2PN受精数/加精卵子数×100%,ICSI 2PN受精率(%)=2PN受精数/注射MII卵子数×100%;(2)2PN卵裂率(%)= 2PN卵裂胚胎数/2PN受精数×100%;可移植胚胎率(%)=可移植胚胎数/卵裂胚胎数×100%;优质胚胎率(%)=优质胚胎数/2PN卵裂胚数×100%;囊胚形成率(%)=形成囊胚数/培养囊胚数×100%;着床率(%)=孕囊数/移植胚胎数×100%;临床妊娠率(%)=临床妊娠周期数/移植周期数×100%;早期流产率(%)=妊娠12周前流产周期数/临床妊娠周期数×100%;分娩率(%)=孕28周后分娩周期数/移植周期数×100%;活产率(%)=活产的分娩周期数/移植周期数×100%

2 结果

2.1 两组基本资料比较 两组双方年龄、BMI以及女方bFSH、AFC、AMH、Gn总用量差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组患者基本资料比较

2.2 两组OPU日精液优化处理前、后精液常规参数比较 与对照组比较，观察组OPU日优化处理前精子活力和PR均下降，差异有统计学意义(P<0.05)。但OPU日优化处理前精子浓度差异无统计学意义(P>0.05)。此外，OPU日优化处理后精子浓度、活力及PR均略下降，但差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 两组OPU日精液优化处理前与精液优化处理后精液常规参数比较

2.3 两组OPU日精子细胞中Bcl-2、Caspase-3蛋白表达比较 与对照组比较，观察组 OPU日精子Bcl-2 蛋白表达下降、Caspase-3 蛋白表达上升，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3、图1。

图1 两组OPU日精子细胞中Bcl-2、Caspase-3蛋白表达

表3 两组OPU日精子细胞中Bcl-2蛋白及Caspase-3蛋白表达比较

2.4 两组IVF-ET/ICSI助孕后实验室和临床结局比较 与对照组比较，观察组2PN受精率、2PN卵裂率及囊胚形成率差异均无统计学意义(P>0.05)；可移植胚胎率、优质胚胎率、着床率、临床妊娠率、分娩率及活产率均下降，早期流产率上升，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 两组IVF-ET/ICSI助孕后实验室和临床结局比较 %(例)

2.5 精子DFI与OPU日精液优化处理前、后精液常规分析参数相关性 精子DFI与OPU日精液优化处理前精子活力呈轻度负相关(r=-0.285，P<0.05)，与禁欲时间、液化时间、精液优化处理前精子浓度和PR均无相关性(r=-0.040、-0.023、-0.124、-0.210，P>0.05)；此外，精子DFI与OPU日精液优化处理后精子浓度、活力、PR均无相关性(r=-0.213、-0.102、-0.124，P>0.05)。见表5。

表5 精子DFI与OPU日精液优化处理前及处理后精液常规参数相关性分析

2.6 精子DFI与OPU日精子中Bcl-2和Caspase-3蛋白表达相关性 精子DFI与OPU日精子中Bcl-2蛋白表达水平呈负相关(r=-0.672，P<0.05)、与Caspase-3蛋白表达水平呈正相关(r=0.627，P<0.05)。

3 讨论

据报道，精子DNA的完整性与精子质量相关，高精子DFI可能影响男性生育力[8-9]。精子DFI可一定程度反映精子活力，且可能与精子浓度呈负相关[10-12]。但有学者指出，精液常规分析结果具有波动性、容易受禁欲时间和生活作息等影响，且精子DNA损伤的病因错综复杂，并不一定可从精子活力的异常上得以如实反映其导致的男性不育[13]。本研究结果发现，精子DFI异常升高时，优化处理前的精子活力降低，且两者呈现轻度负相关。因精子头部控制精子运动，精子根据尾部鞭毛的摆动方式产生直线或曲线运动，并由尾部中段外侧包裹的线粒体鞘提供能量、调节精子运动。当精子头部DNA损伤时，可导致精子线粒体结构和功能异常，从而使精子活力下降[14]。然而，通过密度梯度离心+上游法对精液进行优化处理之后，两组精液常规分析结果无明显差别，故推测即使依据OPU日精液常规分析结果，对IVF-ET/ICSI妊娠结局的独立预测价值可能仍较为局限。

细胞凋亡与维持机体内环境稳态、免疫以及各种疾病发生密切相关，是机体细胞程序性死亡必不可少的表现形式[15]。Bcl-2蛋白家族和Caspase蛋白家族在细胞凋亡中起重要作用。Bcl-2蛋白家族包括Bcl-2、Bax及Bcl-XL等，其家族成员可通过增加线粒体外膜通透性，调节线粒体凋亡途径[16-17]。本研究发现，高精子DFI时，精子Bcl-2表达降低、Caspase-3表达上升，且均呈线性相关改变。当Bcl-2表达降低时，精子线粒体膜平衡状态被打破，线粒体通透性改变，促使细胞色素C(cytochrome C，CytC)和凋亡诱导因子等被转运至线粒体膜外，级联激活Caspase家族，最终激活Caspase-3[15，18]。活化后的Caspase-3可通过解切割DNA依赖的蛋白激酶和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶等，进一步影响DNA复制转录和损伤修复[19]。而CytC可与细胞质中凋亡酶激活因子形成凋亡小体，进一步降解细胞内蛋白，使细胞发生不可逆死亡[20]。通过诱导Bax和线粒体外膜通道蛋白表达、抑制Bcl-2表达，可能加速精子凋亡[21]。

有研究表明，精子DFI对IVF-ET/ICSI助孕结局无明显影响[13，22]。但有学者指出，精子DFI异常升高时，可能影响精卵结合及胚胎发育，降低受精率和优质胚胎率、增加早期流产率[23-27]。本研究结果发现，精子DFI异常升高时，2PN受精率、2PN卵裂率无明显影响，但可移植胚胎率、优质胚胎率、着床率、临床妊娠率、分娩率及活产率均明显降低，且早期流产率明显升高。分析原因可能为：精子本身、卵母细胞及受精后形成的受精卵对于精子DNA的损伤具有一定的修复作用；且父源性基因可能更多地是在胚胎4～8细胞阶段才逐渐表达，故精子DFI异常升高对受精及合子卵裂并无明显影响。

综上所述，精子DNA碎片含量高可能降低IVF-ET/ICSI临床妊娠率。精子DNA碎片发生机制可能与Bcl-2表达下调及Caspase-3表达上调有关，但其具体机制处于探索阶段、目前尚不明确，仍需进行更深入、多中心的研究。

利益相关声明：所有作者均无利益冲突。

作者贡献说明：张先平负责寻找项目资金支持参与实验设计、监督及领导；张慧负责实验开展、实验结果可视化及论文初稿撰写；刘玲、汤鲜、李卓敏负责病例收集及实验设计的核实；贺育兰、李路茜负责实验指导及数据收集；谢巍伟、廖婷负责统计分析及数据整理；贺彩霞负责编辑及论文校对。所有作者均对论文进行了批判性的修改。