啤酒花活性成分黄腐酚治疗骨质疏松症的机制研究进展

赵怡凡 刘天鹏 赵少川 芮 琛 杨 锋

1.陕西中医药大学研究生院，陕西咸阳 712000；2.陕西中医药大学附属医院骨伤科，陕西咸阳 712000

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种以骨量降低、骨组织微观结构破坏为特征的全身代谢性疾病。OP的发生与年龄增长呈正相关，在2019 年流行病学调查中，我国60 岁以上人群的骨质疏松患病率为36%，随着人口老龄化，我国面临的骨质疏松问题将愈为突出[1]。目前临床上防治OP 的常用药物有抗骨吸收、促骨形成两大类，其中抗骨吸收类有：双膦酸盐类、降钙素类、雌激素类；促骨形成的有：甲状旁腺类、锶盐类和活性维生素类。其临床疗效显著，但也存在诸多不良反应[2]，如双膦酸盐类可造成下颌骨坏死[3]，雌激素类可增加心血管疾病发生的风险[4]。因此发掘新的靶向治疗OP 的药物有重大的临床意义。黄酮类化合物广泛存在于自然界的植物中，已被证实具有抗骨质疏松活性，且不良反应小、价格低廉、作用机制广泛，是安全理想的天然抗骨质疏松用药[5]。黄腐酚（Xanthohumol，XN）是啤酒花中特有的一种黄酮类化合物，具有强大的抗氧化应激、抗炎、抗癌细胞增殖等药理作用，并且可作用于成骨细胞（osteoblast，OB）和破骨细胞（osteoclast，OC），靶向刺激相关细胞因子，促进OB 增殖和抑制OC 分化[6]。有相关文献报道，目前国外已有关于XN 防治OP 的专利得到审批[7]。因此加大开发有关XN治疗OP 的靶向治疗研究，并加强对临床治疗的转换具有广阔的前景，本文基于XN 抗OP 的机制研究作一总结。

1 XN 防治OP 细胞水平及相关信号通路的研究

1.1 XN 参与OB 分化及相关信号通路的研究

OB 在骨骼发育中具有重要作用，OB 的分化异常则会造成骨代谢紊乱，从而引发OP 等疾病[8]。有研究证明，成骨细胞与成脂细胞存在竞争性分化的关系[9]，当成脂细胞的分化增高时会对OB 的增殖产生抑制作用，影响OB 的分化与成熟。XN 可通过刺激成骨转录因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）、过氧化物酶体增殖物活化受体γ（peroxisome proliferators activatedreceptor γ，PPARγ）来促进OB 的增殖与转化，抑制脂肪细胞的生成[6,10]。另外，机体在氧化应激状况下会致使体内活性氧化物（reactive oxygenic species，ROS）堆积，刺激OB 的凋亡[11]。当OB 凋亡过多时则会造成骨形成的减少从而引发OP 的发生。研究证明，XN 可刺激核因子红细胞2 相关因子2（nuclear factor eiythroid-2-related factor，Nrf2），促进机体抗氧化应激能力的表达，清除体内堆积的氧化活性产物，抑制OB 的凋亡[12]。

1.1.1 成骨转录因子Runx2 成骨转录因子Runx2 具有促进细胞向成骨和软骨方向分化，在OB 转化中尤为重要，Runx2 能够促使未成熟的OB 增殖和分裂，使未成熟的骨细胞转化为成熟的骨细胞[13]。在特定的诱导环境下，Runx2 还能够促使特定的成骨发育目基因的转录，转录后生成骨钙素、骨胶原等对骨组织生成具有重要作用的蛋白[14]。研究证明，降低小鼠Runx2表达后，其成骨细胞分化受到抑制[15]。综上，说明Runx2 在促使OB 的增殖分化中具有重要作用。Jeong等[16]研究XN 对小鼠C2C12 细胞分化的影响，将C2C12细胞放入XN 溶液中培养，经检测提示EPK、P38 活性随浓度依赖性显著增加，提示XN 可通过上调EPK、P38 的磷酸化来激活Runx2 的表达。夏天爽等[17]将小鼠成骨细胞除空白组外给予地塞米松（Dexamethasone，DEX）损伤，经Western blot 检测显示XN 可显著促进Runx2 的表达，并在对骨代谢指标的检测中发现碱性磷酸酶等成骨基因上升。参考上述文献，提示XN可对Runx2 的表达进行上调来促进OB 的增殖分化，并通过Runx2 表达的增加使成骨相关基因的上升，从而对OP 的发展产生一定的抑制作用。

1.1.2 成脂转录因子PPARγ 成骨细胞和成脂细胞具有竞争性分化的关系，脂肪细胞的分化是一个严格调控的转录级联过程，PPARγ 是脂肪形成过程中的关键调节因子，在成脂分化过程中，AMP 反应原件结合蛋白磷酸化，诱导CEBP-β 的表达，在此基础上激活CEBP-α 与PPARγ 的转录，维持成脂过程的完成[18]。实验证明，当敲除PPARγ 基因时胚胎干细胞的脂肪形成的过程则几乎不能完成[19]。Kiyofuji 等[20]通过培养小鼠3T3-L1 细胞向脂肪细胞转化，随后置入不同浓度XN 中干预，结果显示，XN 的表达呈成浓度依赖性抑制PPARγ 的表达。Yang 等[21]将3T3-L1 细胞分化为脂肪细胞，分时间段干预，通过电泳检测可见XN 显著降低PPARγ，以24 h 时为著。以上研究表明XN 可通过限制PPARγ 的表达来限制脂肪细胞的分化。基于成骨细胞和成脂细胞之间的竞争性分化，而XN 可通过促进Runx2 的表达而上调OB 的分化。因此，对于XN 是否可通过抑制PPARγ 的表达而促进OB 分化的研究具有巨大的前瞻性意义。

1.1.3 抗氧化应激转录因子Nrf2 氧化应激是指体内氧化能力与抗氧化能力失衡使ROS 堆积过多，导致细胞及组织损伤，抑制成骨分化的表达，如碱性磷酸酶，Ⅰ型胶原及Runx2 分化的减少，导致OB 的凋亡及骨形成的减少，促使OP 的发生[22]。Nrf2 是体内重要的抗氧化应激转录因子，正常情况下，Nrf2 与细胞质中的Keap1 结合被泛素化降解；在氧化应激刺激下，Nrf2-keap1 复合物被解离，并转运到细胞核，与抗氧化反应元件结合，促使各种抗氧化酶的表达，如谷胱甘肽过氧化物酶、谷氨酸半胱氨酸连接酶等[23]。Suh等[24]通过甲基乙二醛（methylglyoxal，MG）诱导MC3T3-E1 成骨细胞ROS 以及线粒体超氧化物的堆积造成细胞凋亡。将细胞置于XN 中预处理，随后置于MG中暴露，经检测表明MG 造成的ROS 堆积明显下降，Nrf2 水平随XN 浓度呈依赖性增加。因此，XN 可能通过对Nrf2 的表达进行上调，促进体内抗氧化物的产生或抗氧化活性的增高，抑制ROS 的堆积，从而减少氧化应激对OB 损害的可能性。鉴于此，XN 强大的抗氧化应激能力在防治OP 方面具有广阔的前景。

1.2 XN 参与OC 分化及相关信号通路的研究

OC 是由造血干细胞分化的多核细胞，在核因子受体激活因子-κB 配体[receptor activator of nuclear factor-κB（NF-κB）ligand，RANKL]和巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）的刺激下可促使单核细胞向OC 分化成熟。M-CSF 可促进单核细胞增值与存活，而RANKL 则诱导OC 的分化成熟[25]。两种信号因子可通过一系列信号传导促进OC 的分化。XN 可抑制部分信号的传导，如NF-κB、钙离子/钙调磷酸酶/NFAT 通路（Ca2+/NFATc1）、丝裂素活化蛋白激酶（mitin-activated protein kinase，MAPK）等，对OC 的分化成熟造成干扰，抑制OC 的分化成熟[6]。

1.2.1 NF-κB 通路 NF-κB 属于促进OC 分化的重要转录因子，未活化前与亚单位IkB 在细胞质中结合。当受到相关因子的刺激而激活后，IkB 降解，促使NF-κB 进入细胞核中，启动基因的转录与表达，促使OC 的分化与成熟。RANKL 与RANK 相结合，活化NF-κB/IκB 复合物，促使IκB 的降解与分离，NF-κB 转位进入细胞核中促使OC 的分化与成熟[26]。Li 等[27]将实验组RAW264.7 细胞置于XN 中预处理，随后加入RANKL 诱导OC 的分化，对照组只进行RANKL 处理，经检测发现实验组较对照组IκB 蛋白降解明显降低。谢娟[28]将RAW264.7 细胞置于标记过的NF-κB溶液中培养，随后置于不同浓度的XN 和RANKL 溶液中，将细胞裂解，进行荧光素酶报告基因分析，结果提示，RANKL 可激活NF-κB 的转录活性，而XN 呈浓度依赖式抑制RANKL 激活的NF-κB 的转录。鉴于NF-κB 在OC 的分化中的重要作用，因此研究抑制NF-κB 的分化具有重大意义。参考上述研究，XN 对NF-κB 的转录确有抑制作用，并可能通过抑制IκB 的降解来产生，但XN 对NF-κB 的最佳抑制剂量尚未明确，因此选择合适剂量的XN 来抑制NF-κB 转录的相关研究有待进一步完善。

1.2.2 Ca2+/NFATc1 通路 T 细胞胞质1 的核因子（nuclear factor of activated T-cells 1，NFAT1）是破骨细胞分化的一个关键转录因子，主要诱导破骨细胞在晚期的分化成熟。NFAT 家族主要通过Ca2+激活的钙调磷酸酶来调控，当受到RANKL 的刺激与激活后，NFAT 的丝氨酸结合位点可被去磷酸化，促进NFATc1的入核，完成基因的转录，促进OC 的分化成熟，当敲除小鼠的NFAT 基因后，在RANKL 的刺激下小鼠干细胞不能完成OC 的相关分化[29]。Suh 等[30]将RAW264.7细胞置于RANKL 中处理，随后置于不同浓度的XN中培养。结果显示在4 μg/ml 的XN 干预下，NFAT1显著下降，表明黄腐酚可通过抑制NFAT1 的分化来达到抑制OC 分化的作用。另有研究表明，Ca2+振荡是维持NFAT 转录的关键因素，Ca2+振荡被抑制时，NFAT 则不能完成转录，OC 的分化也受到抑制[31]。Li等[27]将BMM 细胞置于钙流皿中，实验组加入XN 及RANKL 以诱导Ca2+振荡；对照组只加入RANKL，结果显示实验组Ca2+振荡较对照组明显降低。NFAT 在OC分化中的作用具有重要意义，Ca2+振荡在促进NFAT转录中的作用也已得到证实，上述研究提示XN 可能通过抑制Ca2+振荡来抑制OC 的分化，预示着XN 在防治OP 发生的治疗中具有巨大的发展前景。

1.2.3 MAPK 通路 MAPK 是维持OC 分化的重要通路，包括细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinases，EPK）、P38、JNK。RANKL 可激活MAPK，诱导EPK、NFAT1、c-fos 等来刺激OC 的分化，其中EPK1/2 在破骨细胞的分化、成熟及凋亡中尤为重要[32]。M-CSF 与c-Fms 结合，导致c-Fms 尾部的酪氨酸残基的磷酸化，与MEK2 相结合，激活EPK1 的转录，促进EPK1 从细胞质进入细胞核中，启动下级相关因子的磷酸化完成OC 的转录，当敲除小鼠的EPK基因，小鼠体内的OC 分化、成熟及转运将会受到显著限制[33]。Suh 等[30]将RAW264.7 细胞分别置于RANKL中培养，随后置于不同浓度的XN 中干预，随后进行PCR 检测，结果显示，EPK1 以及c-fos 水平受到明显抑制。参考上述研究，推测XN 通过抑制RANKL 对MAPK 的作用，减少其下游相关信号的激活来限制OC的分化、成熟，受限于相关研究量及研究深度不足，尚需加强进一步研究以增强研究的准确性。

2 展望

随着我国人口老年化进程不断加快，OP 防治已成为了一个社会性难题。西药见效快但不良反应多且价格较贵，故人们渐渐将目光转向强调整体防治且不良反应小的天然植物成分中来。关于XN 的细胞实验已经证明XN 在防治OP 方面具有重要的潜在价值。XN 作为一种植物黄酮类成分，具有强大的抗炎及清除氧自由基的作用，并可通过RUNX2、MAPK、NF-κB 等多种通路调节降低骨代谢紊乱所造成的骨小梁缺损及骨矿丢失，同时也可以直接作用于OB 和OC 来影响骨基质的吸收与形成，从多方面来综合实现骨保护作用。我们在探索及回望成就的同时也要清楚客观地意识到：在XN 防治OP 的药物研发上，仍存在研究不够深入等问题，如XN 抗骨质疏松的具体活性成分的靶点不够明确、具体作用分子机制研究不够全面等，还需深入的进一步研究。期待在未来能扩大有关XN防治OP 方面的研究，并加快其对临床治疗的转换，在阐明OP 的根本发病机制的基础上完善临床行之有效的防治策略。