MicroRNA 于弥漫大B 细胞淋巴瘤诊疗中的作用

张翰钰 李敬东

1.河南省新乡医学院第一临床学院，河南新乡 453100；2.河南省新乡医学院第一附属医院血液科，河南新乡 453100

弥漫大B 细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是最常见的非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL），占全球成人NHL 的近30%[1]。该疾病发病年龄为60～70 岁，男性高于女性。DLBCL是一种在临床表现、组织形态、治疗反应及预后等方面有很大异质性的侵袭性肿瘤[2]。目前诊断淋巴瘤的主要依据是病理组织活检，基于组织病理学、基因表达和图像评估指导临床治疗，对于DLBCL 治疗反应监测，临床上常用的方法主要为观察患者淋巴结或淋巴器官肿块消退的情况、影像学表现及临床症状的改善，到目前为止仍无有效、精确、动态的评估方法。所以床上亟待一种新的、无创、高效、更易获得的技术手段用于其诊断和预后评估。随着高通量测序平台的出现及生物信息学的发展，已经鉴定出约有2 100 种不同的MicroRNA（miRNA），其中约有300 种在各种细胞类型中表达。研究显示，miRNA 表达谱可以区分淋巴瘤组织和正常淋巴结，并且在不同亚型中表达程度不同[3]。探索miRNA 在淋巴损伤中的作用将有助于发现新的预后和反应监测生物标志物，越来越多的miRNA被用于恶性肿瘤检测指标的候选者[4]。随着对miRNA的深入研究，其在DLBCL 中的作用逐渐被揭露本文就循环中miRNA 在DLBCL 诊疗中应用的研究进展进行描述。

1 miRNA 与DLBCL 的肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）

1983 年，Pan 和Johnstone 在研究绵羊网织红细胞成熟过程中，发现转铁蛋白受体释放到细胞外空间与一种小囊泡有关，首次发现了外泌体[5]的存在。研究结果提示在正常的生理过程和疾病的发生机制中，外泌体均在细胞间通讯中发挥了重要的作用[6]。其中外泌体中蛋白、RNA 和脂肪成分特异，且携带了一些重要的信号分子，有望在疾病早期诊断中发挥作用，大量文献报道，miRNA 是外泌体最为核心的效应分子[7]。

miRNA 是一类内生的、分布广泛、长度为20～24 个核苷酸组成的非编码RNA（non-coding RNA），是由具有发夹结构的70～90 个碱基大小的单链RNA 前体经过Dicer 酶加工后生成，不同于siRNA 但是和siRNA密切相关，可以与目的信使RNA 的3’-UTR 结合沉默基因的转录进而影响它的表达。miRNA 参与调节多中生物信号传导通路，可调节数百个靶基因[8]。已有研究证实miRNA 参与多种重要的生物程序如细胞增殖、细胞分化、细胞迁移、疾病的发生与发展，调控造血系统及导致血液恶性肿瘤的发生[9]。

B 细胞淋巴瘤是由成熟B 细胞转化而来，主要发生在淋巴结或淋巴系统的其他部位，可以发生在正常B 细胞分化的不同阶段。Arthur 等[10]指出在淋巴瘤中发现基因改变通常与B 细胞发育和/或分化的途径相关，所以B 细胞分化过程似乎容易发生恶性转化。除了基因的改变外，表观遗传调节因子，尤其是miRNA，在B 细胞发育过程中起到了关键作用，同时也参与了B 淋巴细胞的形成。

miRNA 在B 细胞恶性肿瘤中表达的相关性首次在慢性淋巴细胞白血病中（chronic lymphocytic leukemia，CLL）发现，为miRNA 在癌症发病机制中的突出和复杂作用提供了一个模型，特别是在B 细胞淋巴瘤发病机制中。DLBCL 主要内在致癌途径与异常的c-MYC和NF-κB 活性有关，研究证实DLBCL 患者中存在多种miRNA 的异常表达，miRNA 的失调间接抑制某些基因的表达从而导致疾病的发生，其中最常见的是miR-155。近年来，科研工作者对其参与疾病的发生、发展、治疗及预后展开了如火如荼的研究。Zhu 等[11]发现与临近组织比较，淋巴瘤组织中miR-155 表达水平更高，miR-155 下调抑制细胞周期相关蛋白（细胞周期相关蛋白B1、细胞周期相关蛋白D1、CDK4）的表达，但增加了凋亡相关蛋白水平（Bax/Bcl-2 和cas pase3 活性）和抑制炎症因子的分泌。此外，还观察到miR-155 水平与转化生长因子-β 受体2（transforming growth factor-β receptor 2，TGF-βR2）水平呈负相关，TGF-βR2 已被证明是一种新型肿瘤抑制基因[12]。Janus 激酶（JAK）-信号转导和转录激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）信号通路参与细胞分化、增殖和凋亡，并与淋巴瘤有关。细胞信号转导抑制因子3（suppressors-of-cytokine-signaling 3，SOCS3）是JAK-STAT 信号通路的调节因子，生物信息学分析显示，miR155 和SOCS3 存在互补位点。研究显示miR-155-5p 通过SOCS3/JAK-STAT3 信号[13]和靶向SMAD5 促进细胞增殖和阻断凋亡，从而逃避TGF-β1 的生长抑制作用[14]。Li 等[13]通过对DLBCL 及反应性淋巴结增生患者的研究发现DLBCL 组织中miR-155 表达显著增加，而SOCS3 水平下降，并在体外实验中进一步证明miR-155 可以靶向调节SOCS3的表达从而调控JAK-STAT 信号通路从而调控DLBCL 疾病的发生发展。Zheng 等[15]发现miR-155 可作为B 细胞淋巴瘤的致癌标志物，与疾病发生呈正相关，并且与T 细胞受体传导、细胞周期及p53 信号传导途径密切相关。并进行体内外检查发现B 淋巴瘤细胞来源的miR-155 特异性调节Fas 介导的CD8+T 细胞的凋亡，同时发现肿瘤细胞和CD8+T 细胞之间通过miR-155-PD-L1 调节轴的功能相互作用，导致B 淋巴瘤对抗PD-L1 抗体敏感，提示miR-155 是B 细胞淋巴瘤的抗PD-L1 抗体治疗的潜在靶点。

随着对miRNA 研究的深入及生物信息学的快速发展，越来越多的miRNA 在TME 被发现。Xu 等[16]通过挖掘RNA-seq 数据和生物信息学分析，并行体内外实验发现miR-340-5p 与DLBCL 患者CD8+肿瘤浸润性T 细胞（tumor-infiltrating T cells，T-TILs）呈正相关，KMT5A 是miR-340-5p 的直接靶基因，同时也证实了miR-340-5p 通过调节KMT5A 和COP1 并进一步激活CD73 泛素化来促进CD8+T-TIL 浸润和抗肿瘤功能。同样的，李敬东等[17]通过对SU-DHL-4 细胞进行研究证实了miR-34b-5p 过表达导致E-cadherin 基因和蛋白的表达水平升高，而N-cadherin 和Vimentin基因的蛋白表达水平降低，以至抑制SU-DHL-4 细胞增殖、侵袭并诱导细胞凋亡，同时miR-34b-5p 过表达抑制RhoA/ROCK 信号通路。证实了TME 中的CD8+T-TILs 在肿瘤发展中的重要作用。

miR-21 在多种肿瘤中的表达显著升高及其在TME 中显示出调节潜力，其主要作为一种肿瘤抑制因子，对肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移和肿瘤生长起调节作用[18]。相关研究显示，ABT-199 是一种特异性Bcl-2抑制剂，靶向Bcl-2 的BH3 结合域，并在治疗B 细胞淋巴瘤方面显示出令人鼓舞的临床前结果[19]。Zheng等[20]在探索miR-21 在TME 中作用时证实了miR-21作为DLBCL 的血清致癌生物标志物，而且发现mi-R21 通过ICOS/ICOSL 轴增加了Treg 细胞与内皮细胞的相互作用并刺激了肿瘤血管生成。

2 miRNA 与DLBCL 治疗新靶点的探索

2.1 miR-155 在DLBCL 诊疗中的应用

对于DLBCL 的治疗，R-CHOP 方案已成为新诊断DLBCL 患者的标准治疗方案，但仍有一部分患有难治性或复发性疾病的治疗效果欠佳，促使科研工作者们努力探索治疗DLBCL 的新靶点[21]。Cobomarsen 是一种单链、化学修饰的miR-155 靶向寡核苷酸，是一种基于LNA（一种类寡核苷酸衍生物）的抗miR-155化合物，基于这些结果，对于cobomarsen 的治疗作用开展多种临床试验[22]。Anastasiadou 等[23]研究了cobomarsen 在具有高miR-155 表达的ABC-DLBCL 细胞系和异种移植小鼠模型中的功效和药效学活性，并且评估其在侵袭性DLBCL 患者中的治疗效果和安全性的研究中发现cobomarsen 可以与其靶标结合并抑制其作用于miR-155 生物传感器的互补序列，可以被递送并在细胞内具有活性，并且可以抑制miR-155导致DLBCL 细胞增殖减少和凋亡增加。在异种移植小鼠模型中还观察到了静脉注射cobomarsen 可减少肿瘤体积、触发细胞凋亡并抑制miR-155 靶基因表达。同时在诊断为侵袭性ABC-DLBCL 患者治疗中观察到其安全性，不足的是该研究只在1 例患者身上评估了安全性。Huang 等[24]也在探索胃DLBCL 的治疗新方法时发现，miR-155-DEPTOR 通路的激活是对幽门螺杆菌治疗耐药的标志物。虽然上述研究各有局限性，对但仍为DLBCL 的治疗提供了新的思路。

2.2 miR-28 在DLBCL 诊疗中的应用

许多miRNA 位于癌症相关基因组区域并且失调的miRNA 作为致癌基因对多种恶性肿瘤发病机制中发挥作用，这些特征为DLBCL 的治疗新的靶点的研究提供思路。miR-28 是一种在B 细胞转化过程中经常丢失的生发中心（germinal center，GC）特异性miRNA，研究发现miR-28 通过损害记忆B 细胞和浆细胞分化来调节原代B 细胞中的GC 反应。定量蛋白质组学结合转录组分析确定了参与细胞周期和B 细胞受体信号传导的miR-28 靶标，发现miR-28 表达减少了体外原代细胞和淋巴瘤细胞的增殖尤其是在DLBCL异种移植物中的重新表达阻止了肿瘤生长[25]。近年来，miRNA 在癌症发展过程中发挥重要作用使其成为非常有前景的治疗靶点选择[26]。使用合成模拟物阻断DLBCL 生长被认为是治疗性miRNA 引入的最安全的途径，相关实验从治疗角度和毒性分析上验证了miR-28 的毒性远远低于目前治疗B 细胞淋巴瘤的治疗策略，因此miR-28 替代可作为DLBCL 治疗的新策略[25]。

2.3 miR-198 在DLBCL 诊疗中的应用

硼替佐米（Bortezomib，BTZ）是一种蛋白酶体抑制剂，已在美国和欧洲国家被批准用于多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）的治疗，随着对BTZ 研究的深入，越来越多的证据揭示了BTZ 可以抑制活化的B细胞型淋巴瘤的进展。为探索BTZ 在调节DLBCL 细胞生长的潜在分子机制，Wang 等[27]监测到BZT 影响DLBCL 细胞系CRL-2630 的生长并且上调了该细胞系中miR-198 的表达。同时使用信息生物学工具预测miR-198 结合高迁移率组AT-hook1（high mobility group AT-hook1，HMGA1）的3’-非翻译区并抑制DLBCL 细胞中HMGA1 的表达。与BZT 诱导的miR-198 过表达一致，BTZ 抑制了DLBCL 细胞中HMAG1的丰度，HMGA1 的过表达减弱了BTZ 诱导的DLBCL细胞系的凋亡，为DLBCL 的治疗提供新的研究思路。但目前关于miR-198 在DLBCL 中的更多作用未被发现，仍需要进一步探索。

3 miRNA 与DLBCL 预后评估中的作用

尽管标准R-CHOP 化疗可明显改善DLBCL 的临床结果，但对于复发或难治性患者的预后较差[28]。分子异质性导致DLBCL 的多种结果，准确预测疾病复发和存活率对于实施风险适应治疗策略至关重要[29-30]，因此，使用易得的循环预后生物标志物识别高危患者在DLBCL 中非常重要。Sun 等[31]使用miRNA PCR 阵列分析了20 例DLBCL 患者在诊断、缓解和复发时血清样本中的miRNA 表达谱，建立了基于四种循环miRNA（miR-21、miR-130b、miR-155 和miR-28）的预后模型，并在279 例患者的训练队列和225 例患者的验证队列中进行了测试，通过单变量和多变量分析评估显示4 种循环miRNA 预后模型有效地预测了DLBCL的复发和存活，此外TME 有助于其在DLBCL 进展中的作用。同样的，对于不同亚型DLBCL 患者预后的探索发现miR-208a-5p 和miR-296-5p 显示与患者更好的生存相关，而miR-1304-5p 过表达提示生存预后较差，与DLBCL 亚型无关[32]。

最近，在一项DLBCL 患者血清中miRNA 谱的初步研究中发现循环miR-22 与DLBCL 的治疗反应有关，是作为其他独立于公认预后因素（IPI、来源细胞、MYC/BCL2 易位）的预测性生物标志物[33]。在一项探讨血浆中miR-155 对DLBCL 患者预后的评估的研究中发现，miR-155 的相对表达水平与B 症状、LDH 水平、疾病晚期、IPI 评分密切相关，更重要的是miR-155水平升高的患者的总生存期（overall survival，OS）较短[34]。综上，多种miRNA 联合用于DLBCL 预后的评估将是一种更有效的诊断工具。

4 小结与展望

随着生物信息学和高通量测序平台的发展，对miRNA 在DLBCL 疾病的发生机制、良恶性诊断及鉴别、临床治疗新方法的选择及预后中的作用有了更深的认识，将会有更多的研究成果有望指导临床工作，提高患者的生存质量。但多种miRNA 在多种肿瘤细胞中均有表达，缺少特异性，miRNA 在DLBCL 患者中联合应用或许对疾病诊治中的作用更准确。同时开发和广泛验证能够准确提取和重复测量与DLBCL 相关的miRNA 的新方法，将循环标志物、临床参数结合起来，疾病的诊治将会更受益于患者。但是目前对于miRNA 的研究尚未应用于临床，进一步的探索及开发经济的miRNA 试剂盒将有助于基础研究与临床研究相结合。