内皮糖蛋白在维持性腹膜透析患者腹膜血管新生以及纤维化中作用的研究进展

肖蕊，王海萍 ，王荣，孙晶，

1山东大学附属省立医院，山东济南 250021；2山东第一医科大学附属省立医院肾内科，山东济南 250021

近年来，由于人口老龄化和高血压、糖尿病患病率的增加，终末期肾病（ESRD）的患病率呈快速上升趋势，给社会带来了沉重的经济负担[1]。目前腹膜透析、血液透析和肾移植是ESRD患者主要的治疗方法。其中，腹膜透析因其具有保护残余肾功能、维持血流动力学稳定、便于家庭护理等多重优点，被越来越多的ESRD患者选择，目前全世界有超过27.2万人正在接受腹膜透析，占世界透析人口的11%[2]。然而，低pH值、高糖、乳酸盐和葡萄糖降解产物以及终末期糖基化终产物等透析液中的不稳定因素，会使长期暴露于其中的腹膜发生结构和功能上的变化，主要表现为人腹膜间皮细胞的丢失、间皮下致密区增厚、间质纤维化以及新生血管的形成[3]，最终导致超滤衰竭。目前，腹膜超滤衰竭的具体发生机制尚不明确，如何防治腹膜透析患者的超滤衰竭是目前临床研究的热点。内皮糖蛋白（ENG）是一种同源二聚体跨膜糖基化蛋白，属于转化生长因子（TGF）结合蛋白，在内皮细胞表面表达，且几乎在所有的促纤维化细胞中表达，目前发现在血管新生及纤维化过程中起重要作用。本文通过对ENG在血管新生及纤维化中的作用加以综述，并对其在维持性腹膜透析患者腹膜超滤衰竭中的作用进行展望，以期探索有效防治腹膜超滤衰竭的新靶点。

1 ENG概述

1.1 ENG的发现和分布 1985年，QUACKENBUSH等[4]凭借单克隆抗体44G4-mAb研究前B淋巴细胞白血病细胞系从而发现了ENG。1988年，GOUGOS等[5]进行了进一步的研究，指出ENG是血管内皮细胞膜上的一种糖蛋白。1993年，第五届人类白细胞分化抗原的国际协作组会议上，将测定ENG的单克隆抗体归类为一个分化群（CD），并将ENG 编号为 CD105[6]。

研究表明，ENG主要表达在人类的内皮细胞和足月胎盘的合体滋养层细胞的表面，同时也表达在心脏成纤维细胞、肝星状细胞等多种前纤维细胞中，说明ENG在细胞生长分化中具有重要价值[7]。此外研究也发现，其在不同组织中的表达水平也不尽相同：例如在肾小管周围的毛细血管、肾小球系膜周围、肝脏内的细血管及静脉的内皮细胞表达较高；但是在心肌间质、成纤维母细胞和平滑肌细胞的内皮细胞表达相对较低。不仅如此，研究表明，在有受损组织的内皮细胞中ENG的表达会显著升高，这表明ENG与内皮细胞增生密切相关[8]。

1.2 ENG的结构特点 ENG是一种相对分子质量为180 KD的同源二聚体跨膜糖蛋白，在物种间高度同源，人类编码的ENG基因位于9号染色体（9q34.11的长臂上）[5]。该分子含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，根据其胞内结构域长短不同，ENG可分为L-ENG及S-ENG两种亚型，二者胞外结构相同，但L-ENG在胞内区域有47个氨基酸残基，而S-ENG只有14个氨基酸残基[9]。同时，二者的分布具有明显的细胞和组织特异性，L-ENG在内皮细胞中表达最丰富，在大部分组织表达较稳定。而S-ENG在肝脏和肺脏中的表达水平较高，在心脏、脾脏和表皮中的表达水平较低。另外，ENG可被酶切后变成可溶性的ENG（Sol-ENG），存在于血浆、尿液中，Sol-ENG的生物学作用目前还存在争议，可能与ENG竞争性结合相同的TGF-βⅠ型受体。

2 ENG与血管新生

2.1 ENG在血管新生中的作用 血管新生是指在组织缺氧、炎症和损伤等刺激下，内皮细胞激活、细胞外基质（ECM）降解、内皮细胞增殖和迁移、血管腔形成以及血管成熟和稳定的过程，涉及多种细胞及细胞内外因子，如血管生成素、血管内皮生长因子（VEGF）等[10]。

ENG与血管新生有较为紧密的联系，最初JOHNSON等[11]研究发现，ENG和ALK1基因的杂合突变会导致一种显性遗传性疾病——人类遗传性出血性毛细血管扩张症。之后陶方方等[12]分析大鼠模型脉络膜新生血管（CNV）的形成中ENG的变化：CNV形成率在激光视网膜光凝后7、14、21 d分别为77.08%、85.42%、89.58%，提示在脉络膜新生血管形成中，ENG起到重要作用。与此同时，诸多研究发现，在增殖活跃的肿瘤相关血管内皮细胞中，ENG的表达特异性上调，因此研究揭示其有望成为肿瘤血管生成的标志物[13]。此外，TANAKA等[14]检测了实体肿瘤患者、良性疾病患者和健康志愿者血清中ENG的水平，结果显示肿瘤发生转移的患者血清中的ENG水平要高于无转移者，且均高于良性疾病及健康志愿者；然而化疗后血清中ENG显著降低。为进一步明确ENG与传统血管生成标志物CD34、CD31的不同，研究发现ENG在肿瘤组织边缘的新生血管起源的内皮细胞中高表达，且与细胞增殖指标（如Ki67、CyclinA）的表达明显相关，但在正常组织的大血管则为不表达状态，提示ENG与CD34、CD31不同，可作为新生血管的标志物[15]。此外，ENG与肿瘤的转移侵袭也密切相关[16]。VEGF是血管新生过程中的重要细胞因子，ENG在肝癌细胞中以依赖VEGF的方式促进转移，且使肿瘤有更高的侵袭性；ENG还可以诱导肾癌微环境中的血管生成和肿瘤转移，增强内皮细胞的组织性、侵袭性和抗凋亡能力。

同样地，诸多研究表明，ENG的表达下调严重影响了内皮细胞增殖和血管生成。ARTHUR等[17]研究发现，ENG敲基因小鼠的存活时间明显缩短，进一步研究发现其与器官组织血管生成减少密切相关。同时在卵巢癌来源的内皮细胞中下调ENG的表达可明显抑制细胞的增殖和血管生成[18]。表明ENG在内皮细胞增殖与血管生成中扮演重要角色。此外，在ENG杂合突变（Eng+/-）小鼠中，Lewis肺癌异种移植瘤的生长受到损害，肿瘤血管形成相对于野生型（Eng+/+）小鼠受到抑制[19]。ENG的缺乏还会导致血管生成、血管重建和肿瘤生长受损，姚永忠等[20]的研究表明，抑制ENG基因表达后，人脐静脉内皮细胞的生长及形成新生血管的过程均明显受到影响。

2.2 调控与血管新生的信号通路 ENG作为辅助受体可以结合不同类型的TGF-β和骨形态发生蛋白（BMP），但其主要配体是TGF-β1和BMP-9。ENG的信号通路调节存在细胞特异性以及对不同刺激的敏感性。

研究发现，在内皮细胞中，TGF-β1与BMP-9首先通过与TGF-βⅡ型受体（TβRⅡ）和BMP-9Ⅱ型受体（BMPRⅡ）结合从而启动信号传递，触发ALK1或ALK5为主的TGF-βⅠ型受体（TβRⅠ），进而激活下游的不同信号通路，发挥不同的生物学作用[21]。研究表明，TβRⅡ/ALK1复合体可促进Smad1/5/8的磷酸化，磷酸化的Smad1/5/8与Smad4结合，促血管生成相关基因的转录活性，进而促进内皮细胞增殖、迁移和ECM降解。而TβRⅡ/ALK5信号复合体可促进Smad2/3的磷酸化，磷酸化的Smad2/3与Smad4结合，上调ECM、内皮细胞型纤溶酶原激活物抑制因子（PAI-1）和血小板源性生长因子-B（PDGF-B）等的表达，发挥抑制内皮细胞增殖和迁移的作用[10]。因此，在内皮细胞中，ENG对血管新生的调控是通过两种亚型L-ENG和S-ENG，分别激活ALK1和ALK5不同信号通路而发挥不同的生物学作用。L-ENG通过ALK1/Smad1/5/8途径介导TGF-β和BMP-9信号转导，使内皮细胞表型活跃，促进内皮细胞的增殖、迁移及ECM的降解，同时下调PAI-1的表达；S-ENG可通过ALK5/Smad2/3传递信号，上调ECM、PAI-1和PDGF-B的表达，同时抑制内皮细胞的增殖和迁移。

在成肌细胞中，VELASCO 等[22]通过过表达L-ENG或S-ENG发现，二者对TGF-β信号通路有不同的调节作用。L-ENG倾向于通过TGF-β/ALK1/Smad1/5/8途径进行信号转导，从而促进内皮细胞的增殖和迁移，而S-ENG倾向于通过TGF-β/ALK5/Smad2/3途径传递信号，促进ECM合成，阻碍增殖和内皮迁移。可见，L-ENG和S-ENG在调节TGF-β诱导的L6E9细胞的反应和信号转导中起不同作用，有时甚至起截然相反的作用。LIU等[23]用L-ENG和S-ENG转染体外培养的大鼠成肌细胞，继而用TGF-β1刺激细胞，从而探究ENG对TGF-β-ERK1/2-C-Jun通路的调控作用。研究发现，转染ENG的大鼠成肌细胞中细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）、丝裂原激活的细胞外信号调节激酶1/2（MEK1/2）和C-jun磷酸化蛋白的表达均受到抑制；L-ENG的慢性过表达可能通过负反馈机制降低细胞中磷酸化ERK1/2的表达。ENG对TGF-β-ERK1/2-C-Jun通路可能的调控机制为，TGF-β1通过不同途径激活ERK，从而决定内皮细胞的增殖和分化。L-ENG的慢性过表达可能通过负反馈机制或过度刺激ERK1/2的磷酸化或活化，在TGF-β1诱导的MAPK信号通路中发挥负性作用。但仍需进一步的深入实验来研究通路的其他调控因子以及具体作用机制。

因此，笔者推测ENG对血管新生的调控是基于不同刺激下、不同类型的细胞中L-ENG与S-ENG两种异构体存在的平衡，是一个双重且复杂的过程。

2.3 ENG与腹膜血管新生 正常人的腹膜组织由单层腹膜间皮细胞及间皮下结缔组织构成，其中结缔组织成分含有成纤维细胞、免疫细胞（如巨噬细胞和肥大细胞）、腹膜淋巴管和毛细血管[24]。腹膜透析患者由于腹膜组织长期暴露于生物不相容性的腹膜透析溶液以及慢性无菌性炎症状态，可导致腹膜纤维化的出现，最终引起超滤衰竭。而腹腔的乏氧状态可进一步引起腹膜血管新生明显[25]。严富洪等[26]采用尿毒症大鼠作腹膜透析动物模型，并取脏层腹膜予以ENG免疫荧光染色并计数血管。实验结果表明，ENG可以作为腹膜新生血管较好的监测指标，为腹膜血管新生的评估、疾病严重程度的判断、治疗效果的评价提供新的有效的检测手段。

3 ENG与组织纤维化

纤维化是众多疾病终末阶段的病理表现，组织学上其主要特点为肌成纤维细胞的出现及ECM的堆积，可发生于多种器官，其持续进展可致器官结构破坏和功能减退，甚至衰竭。而大量研究显示ENG在纤维化进程中具有举足轻重的作用。

3.1 ENG在组织纤维化中的作用 ENG几乎在所有的促纤维化细胞中表达，包括肾小球系膜细胞、心脏成纤维细胞、皮肤成纤维细胞、肾脏成纤维细胞、肝星状细胞和门静脉成纤维细胞，且作用机制得到进一步论证。CHEN等[27]利用大鼠探究ENG在血管紧张素（AngⅡ）刺激下的基质金属蛋白酶-1（MMP-1）和Ⅰ型胶原表达变化中发现，AngⅡ通过血管紧张素1型受体（AT1-R）上调了ENG的表达，并发挥了促纤维化作用。GERRITS等[28]研究发现，在ENG表达下调时，TGF-β诱导的肾脏纤维化标记物α-SMA的表达显著降低，提示ENG促进成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化；同时还发现TGF-β诱导的结缔组织生长因子和丝氨酸蛋白酶抑制蛋白E1在ENG敲减的细胞中表达降低，提示ENG也促进细胞外基质蛋白的产生。此外，对ENG在心脏纤维化中的作用也进行了深入研究，具体表现为在TGF-β1刺激下，心脏成纤维细胞ENG的表达高度上调[29]，并介导了AngⅡ对心脏成纤维细胞的促纤维化作用。在心力衰竭小鼠模型中发现，ENG的下调可以减轻心脏纤维化，保护左心室功能，并提高存活率[30]。此外，在大鼠心肌梗死模型中发现，心肌组织中ENG的表达水平与梗死面积显著相关[31]。ENG在真皮血管及硬皮病患者真皮成纤维细胞[32]中也存在表达上调现象。上述研究均揭示ENG在肾脏纤维化、心脏纤维化及皮肤纤维化中发挥促纤维化作用。

然而，尚有其他研究认为ENG在纤维化过程中起到抑制作用。DIEZ-MARQUES等[33]观察到，在人肾小球系膜细胞过表达ENG可导致ECM表达下降，即便在TGF-β刺激下，依旧表现出该效应。该结论表明，ENG可能参与了TGF-β1介导的系膜细胞内皮细胞外基质合成的负性调节。此外OBREO等[34]发现，在大鼠成肌细胞中过表达ENG可引起ECM的合成显著降低。RODRIGUEZ-BARBERO等[35]在相同的实验模型中观察到，由于MAPK/ERK通路的激活，ENG过表达介导的Ⅰ型胶原表达减少。这些研究提示ENG在某些条件下可能发挥抑制组织纤维化的作用。OUJO等[36]在单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠肾纤维化模型中发现，L-ENG的过度表达似乎增加了肾脏纤维化，但S-ENG的过度表达似乎减少了肾脏纤维化和炎症。提示ENG的两个亚型L-ENG与S-ENG以不同的方式调节TGF-β下游的信号通路，且该差异调节具有细胞特异性，从而使ENG对纤维化的调控具有组织特异性。

3.2 ENG调节纤维化的作用机制 TGF-β影响许多细胞过程，包括生长、分化、凋亡、趋化和ECM的产生，对生理性和病理性炎症和纤维化有调节作用。TGF-β主要通过Ⅰ型和Ⅱ型TGF-β受体组成的复合物传递信号，TGF-βⅠ型和Ⅱ型受体可以磷酸化ENG胞内区的丝氨酸残基。ENG增加了TGF-β1诱导的Ⅰ型胶原和结缔组织生长因子的表达[22]，在器官纤维化中发挥重要作用。

ENG可以促进TGF-β1-Smad通路中Smad1/5和（或）Smad2/3的磷酸化而调控硬皮病、肝脏、肾脏和心脏等器官的纤维化。但是ENG对纤维化的促进或抑制的作用途径与机制可能取决于细胞和器官组织类型。小鼠肝脏纤维化模型的研究发现，ENG的缺乏上调了促纤维化因子，如α-平滑肌肌动蛋白和纤维连接蛋白的表达，可能是通过调节ALK1和ALK5依赖的TGF-β1信号途径延缓纤维化进程[37]。而在小鼠肾脏UUO实验模型中发现，L-ENG通过促进Smad1/5/8和Smad2/3通路的磷酸化而促进纤维化进程，而S-ENG则通过抑制这一通路的磷酸化起到相反作用[36]。此外，在心脏纤维化的研究中发现，ENG介导了血管紧张素Ⅱ对心脏成纤维细胞的促纤维化作用[27]，有研究观察到Sol-Eng可以抑制心肌成纤维细胞TGF-β1信号转导，同样在心力衰竭的活体模型中也观察到Sol-Eng抑制了心脏纤维化[30]。

TGF-β的激活是腹膜纤维化通路上的一个重要的早期事件，腹膜纤维化机制中，TGF-β1可以通过Smad通路进行信号转导，这表明腹膜纤维化机制中TGF-β通路与ENG调节纤维化的通路具有一致性。因此，ENG在腹膜透析患者的纤维化进程中可能发挥重要作用。

综上所述，众多研究表明，ENG对纤维化的调节作用可能取决于两个亚型主导地位的不同，也可能取决于细胞和器官组织类型。在不同疾病和细胞状态下，可能通过Smad2/3和Smad1/5/8通路之间的平衡来介导TGF-β通路的信号转导，从而对纤维化过程进行调控。

ENG在腹膜透析患者血管新生及纤维化中的作用也值得进一步探索。HAN等[38]从人腹膜灌洗液中分离出腹膜间充质细胞，并做了流式分选，研究表明，ENG可作为间充质基质细胞表面标志物。DU等[39]在大鼠模型上依据流式分选法也检测到了腹膜灌洗液中ENG的表达。CARRERAS-PLANELLA等[40]通过研究腹膜透析患者腹膜透析液中细胞外囊泡中的蛋白质组学发现，ENG在腹膜透析第6、12个月透析液中呈现大富集。本课题组对此进行了相关预实验研究，发现在不同透析年限患者的腹透液中ENG呈现高表达，同时在拔管的腹膜透析患者腹膜组织中进行免疫组化染色发现，腹膜ENG的表达程度有明显差异，且与腹膜纤维化程度相关。ENG很有可能成为腹膜透析血管新生以及腹膜纤维化进程中的新标志物，为疾病的严重程度及治疗效果做更好的监测。

4 展望

ENG通过调控TGF-β通路参与血管新生以及多种疾病的纤维化过程。机体的血管新生需要保持平衡，血管生成过多、血管生成畸形或血管生成不足均会导致众多疾病。ENG在肿瘤等疾病中已证明与血管新生密切相关且与多种疾病的纤维化密切相关，但在ESRD长期腹膜透析患者腹膜血管新生与纤维化进程中的作用尚不清楚。针对ENG在腹膜超滤衰竭中的研究，可为今后的临床工作提供新的治疗思路：①在腹膜透析模型中，对ENG的两个亚型L-ENG和S-ENG及在腹膜间皮细胞中传导信号途径进行研究。②调控ENG的表达对腹膜血管新生和腹膜纤维化可能是一种非常有前景的治疗策略。