沉默OGFR基因对非小细胞肺癌A549细胞株增殖、迁移和侵袭能力的影响

石硕，陈铭伍

广西医科大学第一附属医院胸外科，广西南宁 530021

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一[1-2]，全世界每年报道约180万例肺癌新发病例，占所有新发癌症病例的12.9%[3]。三分之一的肺癌新发和致命病例发生在中国，对人类健康构成巨大威胁[4]。大多数肺癌病例是恶性上皮肿瘤，包括非小细胞肺癌（NSCLC，85%）和小细胞肺癌（15%）[5]。NSCLC临床症状具有隐匿性，大多数患者在确诊时已发生转移，很大一部分患者不能耐受以手术为主的传统治疗[6-7]。此外，手术成功的患者经常出现肿瘤耐药性，导致放化疗失败，肿瘤复发甚至死亡[8]。目前免疫治疗和以抗血管形成为主的靶向治疗虽已广泛应用，但多数患者使用靶向药物治疗后9～13个月会产生耐药[9]。因此探讨新的广谱的分子靶向药物已成为当代医学研究的热点。有研究表明，麻醉和手术期间的可改变条件可能会影响癌症复发，其中一个因素是阿片类药物的用量，接受大量阿片类药物全身麻醉的患者比接受局部麻醉或阿片类药物量较低的患者表现出更多的癌症进展或复发[10]。阿片生长因子受体（OGFR）是一种广泛存在于多种细胞的细胞调节因子，调节细胞分裂和分化[11]，具有促血管生成的作用[10]。GOLDENBERG等[12]研究证实，OGFR可促进肝癌、胃肠道肿瘤等多种癌细胞增殖，同时发现多种疾病存在OGFR表达差异。笔者前期通过基因芯片TCGA、GEO数据库筛选发现，OGFR基因与NSCLC发生发展密切相关。因此，本研究探讨了在体外沉默OGFR基因对NSCLC常用细胞系——人肺腺癌细胞系A549细胞株生物学行为的影响，期待为NSCLC的靶向治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料 A549细胞株购自广西医科大学生命科学院细胞库。总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和cDNA扩增试剂盒均购自日本TaKaRa公司，小干扰RNA由湖州河马生物科技有限公司合成，蛋白标记（Marker）、兔多抗GAPDH、兔多抗OGFR一抗以及抗兔二抗均购自武汉三鹰生物技术有限公司，CCK-8细胞增殖试剂盒购自美国MCE公司，胎牛血清、青霉素链霉素双抗、胰蛋白酶EDTA（0.25%）及酚红均购自美国Gibco公司。

1.2 细胞培养、转染及分组 在37℃、5% CO2环境条件下，将A549细胞株培养在含10%灭活胎牛血清、100 U/L青霉素、100 U/L链霉素的RPMI1640培养基中。显微镜下观察A549细胞株生长状态，当细胞融合度达到70%～80%时，用胰酶进行消化，对A549细胞株进行培养传代，选择对数生长期的A549细胞株进行实验。于转染前24 h，将处于对数生长期的A549细胞株接种于6孔板中，细胞融合度达到70%时进行细胞转染。将细胞分为对照组、实验组，用LipofectamineTM2000分别转染si-NC阴性对照、OGFR特异性的小干扰RNA，在培养箱中培养6 h换液，18～48 h后检测目的基因的表达情况。荧光显微镜下观察转染效率，发出明亮的绿色荧光者为阳性细胞。转染效率（%）=阳性细胞数/总细胞数×100%，取稳定转染细胞用于后续实验。

1.3 细胞中OGFR mRNA检测 采用RT-qPCR。收集转染48 h后两组细胞，使用TRIzol试剂提取细胞总RNA，反转录生成cDNA并扩增进行qPCR检测。反应条件：预变性95℃30 s，1个循环；变性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 34 s，共40个循环。OGFR引物正义序列：5'-UAGAACUCAGUUGGCGTT-3'，反 义 序 列 ：5'-GCCAACAGUUUUUCUATT-3'；内参GAPDH引物正义序列：5'-TCAAGAAGACGGTGAAGCAGG-3'，反义序列：5'-TCAGAAGGTAGGGGACAGGT-3'。 用 2-ΔΔCt法 分 析各组细胞中OGFR mRNA相对表达量。

1.4 细胞中OGFR蛋白检测 采用Western blotting法。收集转染48 h后两组细胞，加入细胞裂解液，抽提蛋白后用BCA法测定蛋白浓度，加入上样缓冲液，后使蛋白变性。取30 μg蛋白上样行凝胶电泳，电泳结束后使用湿转移法转膜，封闭2 h（5%的脱脂奶粉），在4℃下分别孵兔源一抗OGFR，GADPH 4℃孵育过夜（稀释倍数1∶2 000）。24 h后，取出细胞室温下复温1.5 h，用等渗缓冲盐溶液（TBST）洗膜3次，加入通用型羊抗兔二抗（1∶2 000稀释）室温孵育1 h，再用TBST洗膜3次。用凝胶成像系统进行显影，ImageJ软件测灰度 值，随后记录统计分析组织中蛋白的测定。

1.5 细胞增殖能力检测 采用CCK-8实验。取转染后0、24、48、72 h的两组细胞，以5×103/孔的密度转移到平板上。各孔均加入CCK-8染色剂，添加染色剂后，将细胞在37℃下培养6 h。随后，收集细胞悬浮液，采用酶标仪在450 nm处测定光密度（OD）值。

1.6 细胞侵袭能力检测 采用Transwell侵袭实验。取转染48 h后两组细胞，调整细胞密度为1～5×105个/孔，向每组 Transwell小室上室中加入 100 μL相应细胞悬液，下室中加入800 μL含有青霉素链霉素的培养基。37°培养箱温育20～24 h，用棉签去除小室上层细胞，用结晶紫溶液室温下染色后，室温中放置20 min，以磷酸缓冲盐溶液（PBS）浸洗。在显微镜下观察拍照，每个样本随机选择5个视野计数，取平均值。

1.7 细胞迁移能力检测 采用细胞划痕实验。取转染48 h后两组细胞，接种于6孔板，Marker笔在培养板后均匀划间距为0.5 cm的横线，每孔中铺1×105个细胞，细胞融合度≥80%时用无菌移液枪枪头在单层细胞沿底部划出“一”字划痕，PBS冲洗3次，培养24 h后于固定位置用显微镜拍照，并计算划痕愈合率。细胞迁移率=（0 h划痕面积-24 h划痕面积）/0 h划痕面积×100%。

1.8 细胞克隆形成能力检测 采用平板克隆形成实验。收集转染48 h后两组细胞，制备细胞悬液，分别以300个/孔接种到6孔板中。将6孔板置于37°C、5% CO2培养箱中继续培养14 d，直至细胞克隆形成。用4%多聚甲醛固定15 min，再用0.1%结晶紫染色15 min，洗去染液，风干后在倒置显微镜下随机取5个视野观察，判断细胞克隆形成情况并计数大于50个克隆数的集落，实验重复3次取平均值。

1.9 统计学方法 采用SPSS26.0统计软件及Graph Pad软件对实验数据进行统计学分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Student'st检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组细胞中OGFR mRNA表达比较 实验组、对照组细胞中OGFR mRNA相对表达量分别为0.16±0.03、1.00±0.03，两组比较P＜0.05。

2.2 两组细胞中OGFR蛋白表达比较 实验组、对照组细胞中OGFR蛋白相对表达量分别为0.18±0.05、0.53±0.03，两组比较P＜0.05。

2.3 两组细胞增殖能力比较 实验组培养0、24、48、72 h细 胞 增殖 OD 值分别为 0.139±0.015、0.347±0.005、0.372±0.004、0.425±0.003，对照组分别为 0.134±0.018、0.501±0.019、0.676±0.023、0.714±0.022，两组24、48、72 h细胞增殖OD值比较P均＜0.05。

2.4 两组细胞侵袭能力比较 实验组、对照组迁移穿膜细胞数分别为（18±2）、（30±2）个，两组比较P＜0.05。

2.5 两组细胞迁移能力比较 实验组、对照组细胞迁移率分别为（30.13±6.33）%、（61.86±5.32）%，两组比较P＜0.05。

2.6 两组细胞克隆形成能力比较 实验组、对照组克隆形成细胞集落数分别为（115±1）、（211±6）个，两组比较P＜0.05。

3 讨论

OGFR是一种含有677个氨基酸的蛋白质，由20号染色体处的OGFR基因编码，是一种广泛存在于多种细胞中的受体。OGFR可与阿片生长因子（OGF）特异性结合，其调控轴不仅具有神经内分泌和免疫调节活性，而且也具有直接的抗肿瘤活性[13]。近年来，在多种类型的癌症中均发现OGFROGF对肿瘤细胞的生物学行为有调控作用。一项研究表明，OGF是细胞通过自分泌产生的阿片类肽，可显著降低使用放射性标记胸腺嘧啶核苷中的DNA合成，从而调控有丝分裂和细胞的增殖，OGFR与OGF结合后可通过调节细胞周期蛋白依赖性抑制性激酶，作用于细胞周期，诱导细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p16和p21的上调，导致Rb磷酸化抑制和在细胞周期S期停滞，从而对细胞的生物学行为产生影响[14-15]。CHENG等[16]研究发现，OGF通过网格蛋白小干扰RNA受体介导的内吞作用进入细胞膜，随后通过细胞质中的OGFR进一步转移到核内发挥作用，整个OGF进入细胞核的转运过程依赖于核定位信号并通过karyopherinβ1受体介导的核浆转运。ZHENG等[17]研究发现OGFR-OGF调控轴是介导上皮性卵巢癌中LINC00673致癌作用的潜在下游靶点，促进肿瘤的迁移、侵袭和细胞生长。还有研究发现，转染OGFR cDNA后的胰腺细胞，转染组肿瘤发生率增加了45%，肿瘤体积增加了60%，且在随后的研究中证明，OGFR-OGF调控轴在三阴性乳腺癌MDA-MD-231、BT-20等细胞株的增殖中起决定性作用[18-19]。AVELLA等[20]采用高通量测序分析以筛选肝癌细胞中HOTAIR的下游效应因子，发现OGFR在肝癌组织中显著表达，并且发现HOTAIR可与OGFR的启动子区域结合，提高其转录水平，调控肝癌细胞增殖过程。且有研究证实，OGF、OGFR在甲状腺乳头状癌组织及正常组织中发挥着细胞增殖调控作用[21-22]。

为明确OGFR在NSCLC中的生物学功能，本研究采用小干扰RNA技术沉默实验组A549细胞株中的OGFR基因，实验组OGFR mRNA、蛋白相对表达量较对照组降低，表明转染成功。本研究采用CCK-8实验、平板克隆形成实验检测细胞的增殖能力，发现实验组24、48、72 h细胞增殖OD值及克隆形成细胞集落数降低，表明抑制OGFR表达可抑制A549细胞增殖。同时，本研究细胞划痕实验、Transwell侵袭实验结果显示，实验组细胞迁移、侵袭能力较对照组降低，表明OGFR对A549细胞迁移、侵袭起促进作用。本研究结果与既往的多数研究结果一致。MCLAUGHLIN等[22]将人类头颈部鳞状细胞癌（SCCHN）移植到裸鼠体内，然后使用受体结合分析和定量免疫组织化学检测不同大小肿瘤中与SCCHN相关的OGFR mRNA和蛋白表达差异。结果显示，OGFR的表达随着肿瘤的增大而下降，说明在不同体积的肿瘤组织中存在着一定的表达调控差异，这也将是笔者下一步的研究重点。另外，以OGFR为代表的阿片类药物会影响免疫细胞和炎症反应，其在体外、体内模型中发挥的作用可能不同，因此OGFR的机制应在体内实验中进一步评估。

综上可见，沉默OGFR后A549细胞株增殖、迁移、侵袭能力降低，这为后续NSCLC的治疗提供了基础依据。