TGF-β及其信号通路在肝脏疾病中的研究进展

叶 森，王宏宾，付 永

(1.青海大学 研究生院，青海 西宁 810016；2.青海大学附属医院 普通外科，青海 西宁 810000；3.青海省畜牧兽医科学院，青海 西宁 810016)

肝功能受损可影响机体的各个系统，肝脏疾病比任何导致机体功能失调的疾病都具威胁性。病毒性肝炎、寄生虫、酒精、药物等造成的肝纤维化、肝硬化、肝癌等是最常见的死亡原因之一，严重影响患者日常生活及预后[1-2]。近年来随着临床研究的不断深入，炎症相关细胞因子，如干扰素-γ(interferon-γ, IFN-γ)、白细胞介素(interleukin, IL)-2等在肝脏疾病病理、生理过程中的作用逐渐明确，并被证实参与了诸多免疫应答。转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)在肝脏疾病的发生、发展中同样发挥主导作用。因此，了解TGF-β及其信号通路在肝脏疾病中的具体作用机制，对肝脏疾病的进一步研究及治疗具有重大临床意义。

1 TGF-β及其信号通路

1.1TGF-β组成 根据序列相似性和信号特异性，可将TGF-β超家族进一步分为TGF-β、激活素、抑制素、Nodal、骨形态发生蛋白 (bone morpho-genetic protein, BMP)、生长分化因子(growth differentiation factor, GDF)、胶质细胞源性神经营养因子(glial cellderived neurotrophic factor, GDNF)和缪勒氏管抑制物(mullerian in-hibitor substance, MIS)等。TGF-β在胚胎发育过程中组织细胞形成及维持细胞稳态中均发挥重要的调节功能[3]。TGF-β在机体大多数细胞中均可表达，在机体正常生长、发育和保持机体平衡中起主导作用。TGF-β的主要配体有3种：TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3，三者具有相似的生物活性，通过旁分泌和自分泌途径调节细胞功能，在机体细胞增殖、凋亡、分化及类固醇生成等过程中起重要作用。TGF-β还有3种相对应的TGF-β受体(transforming growth factor-β receptor, TβR)：TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ和TβR-Ⅲ[4]。Smads蛋白作为细胞信号转导蛋白，活化后在TGF-β信号通路中发挥关键作用，能够将TGF-β信号从细胞外转移至细胞核，进而发挥重要的生物学功能。根据各自特有的结构和功能，Smads蛋白可分为3种不同的亚型：受体活化型或通路限制性Smad(R-Smads)、共同通路型Smad(co-Smads)和抑制性Smad(I-Smads)。R-Smads为Ⅰ型受体Smads激酶的底物，活化TGF-β信号通路的胞内转导，包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8，其中Smad2、Smad3被TGF-β磷酸化，BMP受体使Smad1、Smad5、Smad8磷酸化，故TGF-β信号通路的重要参与者为Smad2及Smad3，而Smad1、Smad5、Smad8则参与了BMP信号的传递过程[5-6]。Co-Smads包括Smad4，主要起辅助TGF-β/Smads信号通路进行胞内转导的作用。I-Smads包括Smad6及Smad7，具有保守的羧基端MH2结构域，但与R-Smad、co-Smad比较，氨基酸末端区域高度分化。Smad6优先抑制BMP I型受体ALK-3和ALK-6启动的Smads信号，而Smad7则抑制TGF-β和BMP诱导的Smads信号传导，此外，I-Smads还调节一些非Smads信号通路。研究表明，I-Smads功能的发挥受各种酶的调节，包括泛素连接酶、乙酰转移酶、脱乙酰酶和甲基转移酶等，但这些酶的具体作用机制有待进一步研究[7-8]。

1.2TGF-β信号通路

1.2.1经典的TGF-β/Smads信号通路 正常情况下，TGF-β存在于细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，完全处于静止状态。信号开始传递的标志是TGF-β的一个配体首先与TβR-Ⅱ结合，将TβR-Ⅰ、TβR-Ⅲ汇聚，然后TβR-Ⅰ发生磷酸化，TGF-β/Smads信号就发生了。磷酸化后的TβR-Ⅰ继续在其羧基末端的丝氨酸残基(pSmad2/3C)上将Smad2及Smad3相继磷酸化，进而招募Smad4并与之形成复合体，实现信号从细胞外转移至细胞核，调控相应靶基因的转录[9-10]。

1.2.2非经典的TGF-β信号通路 除了Smads介导的经典TGF-β信号通路外，TβR还能通过各种化学方式，如磷酸化或者直接作用等，来激活细胞内的其他信号通路，如细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases, ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases, JNK)、丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen activated protein kinases, MAPK)及RhoA/ Rho激酶(RhoA/Rho kinase, RhoA/Rock)信号通路等，称之为非经典的TGF-β信号通路[11]。研究发现，TGF-β激活后可以依次活化ERK、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase, p38MAPK)/JNK及Rock等信号通路，参与调控细胞的正常生长、迁移、免疫抑制及内皮间质转换[12]。

2 TGF-β及其信号通路与肝脏疾病

肝脏疾病影响着全世界数以百万计的人。由于全球现代肝脏疾病学的预防、诊断和治疗的不断进步，在大多数发达国家慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B，CHB)的发病率正在急剧下降[13]。乙型病毒性肝炎抗病毒系统综合免疫治疗方案的不断扩大，大大减少了包括中国在内的许多国家的新感染病例数。但是，CHB仍然是严重威胁我国居民身体健康的慢性传染疾病之一。此外，由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)、细菌、寄生虫感染及饮酒、饮食等原因引起的肝纤维化、肝硬化及肝癌仍引起社会各界密切关注[14-15]。以下分别阐述TGF-β及其信号通路在CHB、肝纤维化、肝癌、肝棘球蚴病中的研究进展。

2.1TGF-β及其信号通路与CHB 研究表明，CHB可引起单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤(natural killer, NK)细胞、T细胞的天然免疫和适应性免疫功能障碍[16]。TGF-β1影响机体免疫细胞的发育和成熟，维持机体免疫耐受和平衡，调节免疫反应的各个方面，在CHB发生发展中发挥关键作用[17]。辅助性T细胞17 (T helper cell 17, Th17)、调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)在CHB的发生发展中发挥重要的作用，Treg主要通过细胞膜表面的分子与细胞直接接触的方式发挥作用，诱导产生细胞因子IL-10和TGF-β发挥作用。Th17源于原始的辅助性T细胞，与Treg作用相反，正常情况下两者保持平衡，维持机体的免疫稳定。有研究表明，CHB患者外周血中Treg相关细胞因子IL-10、TGF-β1及Th17相关细胞因子IL-23的表达显著升高，充分证实Th17/Treg平衡参与CHB的发生、发展，而TGF-β1作为Treg代表性细胞因子通过影响Th17/Treg平衡间接参与CHB的发生、发展[18]。

研究还发现，机体健康肝细胞表达TGF-β1较少，但随着HBV的感染，肝细胞相继发生变性、坏死、纤维化，共同作用于Kupffer细胞，刺激其合成、分泌大量的TGF-β1[19]。同时相关研究也证实CHB患者外周血TGF-β1水平明显高于健康对照组，与HBV-DNA荷载量呈明显的正相关[20]。进一步研究发现，TGF-β1与CHB抗病毒药物治疗的实际疗效相关，目前临床常用的抗病毒药物，如阿德福韦酯及恩替卡韦等，均可引起HBV-DNA滴度明显下降，进而使TGF-β1水平显著降低[21]，充分证实了TGF-β1水平可作为反映CHB患者抗病毒治疗效果以及机体炎症因子平衡状态的一项重要指标。Li等[22]为探讨炎症细胞因子与CHB发生、发展的关系，选取HBV包膜抗原(HBeAg)阳性患者250例进行研究，测定患者入院时的血清学指标和TGF-β水平，结果发现，TGF-β是CHB的独立影响因素。研究发现，乙肝病毒x蛋白(hepatitis B virus x protein, HBx)可以通过与Smad4的直接作用激活TGF-β途径[23]，而Smad7在抗病毒治疗成功后炎症消退的过程中被表达上调[24]。后续仍需进一步的研究阐明TGF-β参与CHB发生、发展的具体机制。

2.2TGF-β及其信号通路与肝纤维化 肝纤维化是机体对各种致病因素导致肝细胞慢性损伤进行功能修复时发生反应进而引起的慢性肝脏疾病。多种致病因素，如HBV、寄生虫、乙醇、药物、脂肪肝、自身免疫性疾病等，均可直接引起肝纤维化，并进一步形成肝硬化，甚至肝癌[25]。其中涉及的重要机制是，肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)激活转变为肌成纤维细胞(myofibroblast, MFB)，导致胶原蛋白合成增多，并过量聚积。多种信号通路参与了肝纤维化的发生，其中在正常肝组织中表达较低而在肝组织受损时被激活且表达增加的TGF-β被认为是肝纤维化发生的关键因子。在正常肝脏中，HSCs以静止的非增殖状态存在。在急性和慢性肝损伤期间，ECM中的TGF-β被激活，并在各种细胞中表达和释放。这种情况下，TGF-β的一个重要靶点是诱导激活并转化为MFB的HSCs，具体机制包括细胞内维生素A的丢失、成纤维细胞形状的适应以及收缩、增殖和迁移表型的形成等[26]。ECM主要来源于激活的HSCs、骨髓源性纤维细胞、发生上皮间质转化(epithelialmesenchymal transition, EMT)的肝细胞和发生EMT的胆管细胞。正常肝脏中的ECM处于生成和降解平衡，当发生肝损伤时，肝脏愈合反应使ECM沉积过多而导致纤维瘢痕增生最终发生肝纤维化[27]。进一步研究证明，TGF-β1可通过上调主要ECM蛋白(如纤维连接蛋白和胶原)、整合素、基底膜蛋白(如层黏连蛋白、Ⅳ型胶原蛋白和巢蛋白)的表达使ECM增多；在调节ECM功能方面，TGF-β1可在伤口愈合反应中诱导ECM中肌腱蛋白表达，该蛋白在正常肝组织中几乎不表达，但在纤维化肝组织内可促进细胞的迁移和增殖[28]。

下游分子Smad3被认为是TGF-β活化HSCs导致纤维化的主要介质。研究表明，Smad3和维生素D受体(vitamin D receptor, VDR)存在关联，TGF-β信号在HSCs的全基因组VDR结合位点(VDR顺反子)中产生再分配，通过TGF-β介导的染色质重塑，促进VDR与Smad3依赖性靶基因启动子的结合，从而使纤维形成，基于这一机制，VDR配体可抑制TGF-β诱导的HSCs激活，并消除肝纤维化[29]。相关研究表明，Smad7对TGF-β负性调节作用机制为通过上调DNA甲基化转移酶1(DNA methyltransferase 1, DNMT1)的表达介导对Smad7表观遗传的抑制，从而促进TGF-β介导的纤维化[30]。肝纤维化时，Smad2、Smad3被强烈激活，并且Smad3是导致纤维化的关键因素。Smad4与Smad3相互作用并参与下游促纤维化靶基因的转录，而Smad7以两种不同的方式负调控TGF-β/Smads信号。一种是Smad7与TβR-Ⅰ结合以阻止Smad2/3的磷酸化，另一种是Smad7将泛素连接酶E3、Smad泛素化调节因子招募到Smad2，TβR-Ⅰ泛素化并降解这两种蛋白质[31]。Smads正负信号之间的不平衡可能在肝纤维化的发展中起着至关重要的作用。

大多抗纤维化药物通过TGF-β/Smads信号通路发挥作用，例如，在肝纤维化大鼠模型中，厚朴酚可抑制TGF-β/Smads信号通路的活化，有效逆转肝损伤；强效精准的第二代酪氨酸激酶抑制剂尼洛替尼可降低TGF-β1水平，抑制炎性因子的释放，抑制四氯化碳诱导的肝纤维化，发挥潜在的抗纤维化作用[32-33]。此外，在人源及鼠源纤维化肝组织中，存在10-11易位蛋白3(ten-eleven translocation 3, Tet3)表达，Tet蛋白属于一种新的DNA脱甲基酶，在癌症的进展中发挥重要作用，但对其在肝纤维化中作用和机制知之甚少。Xu等[34]研究发现，Tet3和TGF-β1在肝细胞中存在正反馈，Tet3表达增加，促进TGF-β1的表达上调，诱导HSCs分化为MFB，抑制Tet3/TGF-β1信号通路可以减轻小鼠肝纤维化，证明Tet3和TGF-β1是肝纤维化的重要决定因素。因此，深入研究TGF-β/Smads信号通路上下游的调控机制有助于更好地研发靶向抗肝纤维化药物。但由于TGF-β的生物学功能广泛，目前发现的靶向药物不良反应显著，已超出了治疗获益， TGF-β及其信号通路在肝纤维化中的作用仍需更进一步深入研究。

2.3TGF-β及其信号通路与肝癌 TGF-β作为人体免疫系统的多功能调节者，可控制细胞和组织分化，并维持机体平衡，与肝癌的发生、发展密切相关[35]。肝癌的演变过程是一个多步骤进展的过程，大多数肝癌都发生在CHB或者肝硬化后。TGF-β及其信号通路在肝癌发生、发展的各个阶段均发挥关键作用，在肝癌细胞和周围肿瘤基质之间发挥直接介导作用。有研究发现，TGF-β1在肝癌组织中过表达[36]，与宋培军等[37]研究结果一致。进一步研究表明，TGF-β1水平与肝癌进展和不良治疗结果直接密切相关[38]。在肝癌发生早期，TGF-β可以对肝细胞的增殖、分化产生明显抑制作用；在肝癌后期则显著促进ECM的形成、EMT及肿瘤的恶性浸润，TGF-β信号通路通过各种方式，如充当自分泌或旁分泌生长因子，诱导机体微环境发生改变，使之朝促进肝癌发展的方向进展[39]。TGF-β也会引起肿瘤细胞可塑性的改变，从而赋予移行性肿瘤起始细胞(tumor-initiating cell, TIC)的特性，进一步促进肝癌的发展[40-41]。TGF-β信号通过多种通路影响肝癌的发生、发展，其中最重要的信号通路是Smads通路。研究证实，在肝癌发生、发展的过程中，TGF-β在病程早期发挥抑制肿瘤进展作用，而到病程后期则转变为促进恶性肿瘤细胞增殖、浸润的作用，并由Smads通路介导[42]。

TGF-β生物学作用广泛，其在肝癌中的生物学作用却并不常见。要想有效利用肝组织中的TGF-β转导途径，需要更好地理解其在肝组织中的复杂作用，包括对不同类型肝细胞的多种作用。尽管TGF-β及其信号通路的作用尚未完全明确，但控制TGF-β及其信号通路仍被认为是一种延缓肝癌进展的好方法[43-44]。进一步深入研究TGF-β/Smads通路在肝癌治疗中的作用及机制可为有效防治肝癌的早期发生及提高后续治疗效果提供理论基础。

2.4TGF-β及其信号通路与肝棘球蚴病 随着对各种寄生虫治疗方法的不断改进，华支睾吸虫、肝片形吸虫、肝毛细线虫所引起的各种肝脏疾病的发病率已经明显下降，相关的医学报道相对较少。但是，我国西部地区棘球蚴病发病率仍较高，应引起关注。棘球蚴病多发于人的肝脏，其次为肺、脑、骨，未及时治疗或长期治疗不当的肝泡型棘球蚴患者10～15年死亡率高达90%，肝囊型棘球蚴病死亡率为2%～4%[45]。棘球蚴侵入中间宿主后，在包囊及一些棘球虫体的黏液和分泌物联合作用下，使机体的免疫功能发生一系列变化，并对免疫系统造成严重损害，逐渐形成一种病理性的免疫逃避机制。棘球蚴病的自体抗原既可含有感染虫体、虫体细胞表面的自身代谢抗原，也可含有少量来自于感染虫体内部分泌物、排泄物、囊液的自身代谢抗原。这些免疫抗原可直接诱导人体宿主细胞产生各种免疫应答。

TGF-β在肝棘球蚴病的发生、发展中发挥重要作用[46]。TGF-β在肝泡型棘球蚴病变组织和器官中明显升高，特别是在纤维化区域，提示TGF-β可能引起肝泡型棘球蚴患者组织器官的纤维化和ECM的过度沉积[47]。Wang等[48]采用Westernblot、qRT-PCR和免疫组织化学方法检测肝泡型棘球蚴感染后第2～360天小鼠模型的TβR、下游Smads信号活化以及纤维化标记物的表达，结果显示，在泡球蚴小鼠中TGF-β、TβR及其下游Smads在肝周浸润和肝细胞内均有明显表达，再次验证TGF-β及其信号通路在肝泡型棘球蚴病中起着重要的免疫耐受和肝纤维化作用。Zhang等[49]研究证明，TGF-β的持续表达可能导致人自然杀伤细胞家族2成员D(natural-killer group 2 member D, NKG2D)的调节，进而抑制NKG2D依赖的细胞毒性。这种信号系统的异常可能是导致寄生虫逃避宿主免疫的机制之一。肝囊型棘球蚴病发生于中间宿主，但通过抑制TGF-β信号减轻肝囊型棘球蚴病变相关肝损伤的作用仍有待于进一步研究。有研究发现，联合应用TGF-β信号抑制剂和吡非尼酮可降低TGF-β信号通路相关蛋白的表达和胶原的生成[50]。说明TGF-β在减轻肝细胞衰老和恢复肝功能方面具有较高的潜力。目前关于肝棘球蚴病与TGF-β信号通路的研究不多，缺乏足够的理论支持，进一步研究TGF-β信号通路或能成为肝棘球蚴病相关性肝纤维化的治疗靶点。

3 小结

综上，TGF-β及其信号通路在肝脏疾病发生、发展中起着至关重要的作用。由于TGF-β的生物学作用广泛，已研发的药品不良反应较大，进一步明确TGF-β及其信号通路在肝脏疾病中的具体作用机制，可筛选出与肝脏疾病相关的治疗靶点，为肝脏疾病的进一步研究提供更多理论支持。