南极磷虾活性肽的研究进展

张 伦，骆鑫鑫，王 斌，赵玉勤

（浙江海洋大学食品与药学学院，浙江舟山 316022）

肽（peptides）是20 种天然氨基酸通过不同组成和排列方式构成的，从二肽到线性或环形结构的多肽的总称，并且把能够在人体内发挥生理功能具有活性的多肽称为活性肽。活性肽其分子结构都具有特殊的组成结构，不同的组成结构决定了其特有的活性功能，如抗氧化肽，抑菌肽、抗疲劳肽、降压肽、免疫活性肽等[1-6]。人工获得肽的方法有多种，主要有微生物发酵法、酸法、碱法、电法、人工嫁接法、基因表达法、酶解法等。酶解法就是用生物酶催化蛋白质水解获得的肽。酶法较酸法、碱法、电法温和、环保，并且具有生产工艺简易，投资少、见效快，适宜工业化生产等优点。

南极磷虾Euphausia superba 属于节肢动物门，甲壳纲，磷虾目，是栖息于南大洋中的甲壳类生物，成体长约40～60 mm，群栖生活，密度达每立方米10 000～30 000 只，总蕴藏质量为（3.42～5.36）×108t[7]，是地球上多细胞动物中生物数量最大、繁衍最成功的单种生物资源之一，是整个南极生态系统中能量和物质流动的基础环节[7-8]，并且南极磷虾的可持续捕捞量可达世界现有渔业总产量的1 倍以上，是人类重要的动物蛋白资源库，具有巨大的开发和应用潜力[8]。通过对南极磷虾的营养成分分析，其肌肉中含有约78%的蛋白质，8%的脂肪，27%的脂肪，含有18 种常见氨基酸，其中包括8 种人体必需氨基酸（essential aminoacid，EAA），其中必需氨基酸含量为25.88%，18 种水解氨基酸中，谷氨酸含量最高10.90%，赖氨酸含量次之5.93%，其余含量较高的还有丙氨酸、亮氨酸。同时富含多种微量元素及EPA 和DHA 等n-3 多不饱和脂肪酸[9]。因此，近年来南极磷虾研究已成为食品科学、营养学、医学和药学等学科的热点之一，为开发南极磷虾活性肽作为医疗保健产品和药品提供了理论依据。

1 南极磷虾活性肽的开发工艺

南极磷虾蛋白资源开发具有巨大的发展空间，但是阻碍其产业化发展的重要的因素之一是南极磷虾由于其自身体内蛋白酶系统的特点，在其死后短时间内蛋白品质及营养价值的会迅速降低[9]。有研究指出，0～5 ℃条件下，南极磷虾在15 h 后品质会产生变化，基本失去利用价值；20 ℃条件下，南极磷虾在8 h后品质会产生变化，基本失去利用价值[10]。因此，急需发展对南极磷虾蛋白资源进行优化利用和高值化加工的新的思路与技术，近年来通过添加外源酶水解蛋白制备生物活性肽的是其中有效途径，成为新的研究热点[11]。

由于化学水解法其反应条件过于剧烈导致氨基酸结构受损严重，从而很少被用于制备活性肽。目前关于南极磷虾肽的制备，多采用生物酶法在最适条件下对蛋白质进行降解得到具备生物活性的二肽、寡肽、多肽等；研究证明，分子质量小于1 kDa 的短肽，更易被人体吸收利用[12]，而酶解后的残渣可以回收利用，安全无害，可用于食品工业生产，实现资源的高效利用。

李明杰等[13]通过正交试验优化了南极磷虾活性肽的提取条件，确定了木瓜蛋白酶水解南极磷虾蛋白在最佳料液比、加酶量、酶解温度、酶解pH 以及酶解时间等工艺条件下，水解度可达24.7%。经喷雾干燥后，所获得活性多肽具有良好的自由基清除能力。吉薇等[14]采用动物蛋白水解酶酶解南极磷虾，优化温度、反应时间、pH、酶添加量等酶解工艺，依据中心组合实验设计原理，在单因素试验的基础上，运用4 因素3水平的响应面分析法，建立二次多项式数学模型，并以DPP-IV 抑制率为响应值作响应面筛选最佳生物酶解工艺。刘云姣等[15]以南极磷虾蛋白酶解液中的氨基氮含量为指标，采用甲醛电位滴定法测定碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、胃蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶6 种生物酶在其各自的最适条件下对南极磷虾蛋白酶解效果，筛选出酶解南极磷虾蛋白最佳生物酶。在单因素试验基础上，通过三因素三水平Box-Bohnken 响应面分析法对筛选出来的生物酶解工艺进行优化。进一步在优化酶解工艺的基础上，利用SDS-PAGE 凝胶电泳方法分析南极磷虾酶解蛋白肽及南极磷虾蛋白的分子量分布范围。通过模型分析得最佳条件：酶解温度44.48 ℃、酶解时间8.52 h、pH 7.88，通过电泳分析得到南极磷虾蛋白胰蛋白酶解多肽分子量在25 kDa 以下，主要分子量分布在5 kDa 以下。高颖等[16]建立了从脱脂磷虾粉中高效提取低氟蛋白质的工艺，并在此基础上研究了经过不同蛋白酶水解后南极磷虾肽的体外功能活性。研究确定了3 种低氟磷虾肽的制备工艺，蛋白回收率均高于70%，并且蛋白含量高于90%，灰分含量均低于7.0%，氟含量低于15 mg·kg-1，分子量在200～2 000 Da 范围之间，必需氨基酸含量高，碱性蛋白酶水解肽和中性蛋白酶水解肽在分子量分布、氨基酸组成及二级结构方面一致性较高，并且二者的ACE 抑制作用显著优于胰蛋白酶水解肽；但胰蛋白酶水解肽的抗氧化性显著高于中性蛋白酶水解肽和碱性蛋白酶水解肽。进一步研究发现3 种磷虾活性肽的体外活性与其分子量大小、氨基酸组成和二级结构具有较高相关性。

2 南极磷虾活性肽的研究

2.1 抗氧化肽

抗氧化剂通过清除自由基引发剂或中间产物、清除单态氧自由基、钝化金属催化剂等途径干扰氧化反应，目前由于合成抗氧化剂存在潜在的安全隐患，对人体的组织器官可能产生一定的副作用，因此作为无毒副作用风险的蛋白酶解抗氧化肽具备广阔的开发利用潜力。同时抗氧化肽还具有多肽产品的营养和保健作用，可以提高机体抗衰老、抗疾病能力。研究表明，许多动植物的水解蛋白和氨基酸都具有抗氧化活性[15-16]。

海洋生物活性肽主要通过清除体内活性氧和自由基或干扰氧化链式反应来抑制氧化损伤[16]。有文献报道，分子量在3～10 kDa 的磷虾多肽清除自由基能力强于天然抗氧化剂维生素E[13]。王继宏[17]以南极磷虾蛋白为实验材料，发现使用胰蛋白酶-中性蛋白酶复合酶解，时间为6 h 时得到多肽抗氧化活性最好，其DPPH·、超氧阴离子，羟基自由基的清除率分别为72.7%、11.5%、84.8%。通过将南极磷虾蛋白酶解物分级分离成分子量不同的5 个组分，CPH I（10 kDa）、CPHⅡ（5～10 kDa）、CPH Ⅲ（3～5 kDa）、CPH Ⅳ（0.5～3 kDa）和CPH V（0.5 kDa）。5～10 kDa 的南极磷虾多肽抗氧化活性最好。张元元等[18]发现以清除超氧阴离子、羟自由基和DPPH 的能力为指标木瓜蛋白酶水解制备的多肽抗氧化活性比较好，并用响应面法优化木瓜蛋白酶水解南极磷虾制备多肽的工艺参数，采用凝胶电泳显示该多肽有3 个明显条带，其分子量大多位于3～7 kDa。张风等[19]以凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei 虾头、虾壳为原料，碱法提取蛋白质后，采用不同的蛋白酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶）酶解，以抗氧化活性和水解度为指标，筛选最佳水解用酶，并对该酶的酶解条件进行优化，对优化所得酶解物的抗氧化活性进行初步研究。结果表明，风味蛋白酶为最佳水解用酶，虾头虾壳蛋白质水解制备抗氧化肽的最佳工艺条件为：温度54 ℃、时间10.5 h、pH8、加酶量8 000 U·g-1，此条件下5 mg·mL-1该酶解物的DPPH 自由基清除率为82.09%，为相同浓度下维生素C 抗氧化活性的90.50%，0.5 mg·mL-1时氧化自由基吸收能力为126.16 μmol·L-1，相当于相同浓度VC 活性的79.73%。

2.2 抑菌肽

抑菌肽是自然界中天然存在的一类生物活性肽，具有分子量小、活性强、热稳定性好，抗菌谱广、抗菌机理独特且不易产生耐药性等优点，广泛存在于各类动植物和微生物中,是天然免疫系统的重要组成部分。抑菌肽一般具有抗细菌或真菌的作用，有些还具有抗原虫、病毒或癌细胞的功能，而对正常细胞影响较小，因此成为近年来国内外抗生素替代品的研发热点[20]。

人类首次提取的天然抗菌肽是HULTMARK，et al[21]从北美天蚕蛹Hyalophora cecropia 的免疫血淋巴中提取出P9A 抗菌肽和P9B 抗菌肽；DESTOUMIEUX，et al[22]从凡纳滨对虾血细胞中分离出对虾肽penaeidin（pen-1、pen-2、pen-3），并通过对penaeidin 基因表达和肽分布的分析，发现对细菌有很强的抑制作用，还具有广谱抗真菌活性。天然抑菌肽通常是由12～60 个氨基酸组成的小肽，由于其N-末端富含赖氨酸、精氨酸和组氨酸等阳离子型氨基酸,抗菌肽通常带有正电荷，等电点大于7，表现出较强阳离子特征。

南极磷虾抑菌肽的制备通常采用复合酶酶解南极磷虾，并对酶解多肽进行多肽含量及分子量分布测定及抑菌活性检测，赵玲等[23]发现南极磷虾酶解多肽的含量可达81.44%，相对分子质量范围为254～10 000 Da；并采用滤纸片法通过测定对枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、大肠杆菌Escherichia coli、四联微球菌Micrococcus tetragenus、啤酒酵母Saccharomyces cerevisiae 和副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus 6 种菌的抑菌活性，得出酶解多肽对金黄色葡萄球菌有明显的抑菌活性，且组分Ⅲ的抑菌效果明显优于其他组分。但是由于所获得南极磷虾抑菌肽分子量较小，增加了在产业化中分离纯化的难度，因此进一步发展其高效的分离纯化技术具有重要的意义。赵玲[24]通过中性蛋白酶和胰蛋白酶双酶在温度50 ℃，水解时间3 h，双酶加酶量之比2：5，双酶添加量3 000 U·g-1底物条件下水解制备南极磷虾抑菌活性肽混合物，采用小型切向流超滤系统、超滤杯和阳离子交换层析初步纯化得到一个分子量范围在254～709 Da 的混合肽（CMCC-1，其最低抑菌浓度为5 mg·mL-1）并推测南极磷虾抑菌肽对金黄色葡萄球菌的抑制作用是通过破坏菌体细胞壁和细胞膜，改变了细胞膜的通透性，导致大量胞内物质外泄，从而引起菌体死亡。

2.3 金属螯合肽

金属螯合肽是指能与金属离子发生螯合作用，并促进机体对所需金属元素的吸收，或其能够通过与铁离子、铜离子的结合从而阻断自由基的生成，实现其抗氧化活性的活性肽[25-26]。研究发现金属螯合肽可通过肽的吸收途径被人体所吸收，从而增加金属离子的吸收利用率，而且相对于氨基酸金属元素螯合物具有更高的配合率和稳定性，具有很高的开发价值和广阔的应用前景。

近几年，有关酶解法制备金属螯合肽的研究主要集中在多肽酶解工艺优化等方面，汪婵等[27]发现在一定范围内金属螯合率与水解度呈正相关性,在底物质量浓度5%，酶添加浓度20 U·g-1底物，水解时间5 h的酶解条件下产物的金属螯合率最强，与Fe2＋的螯合率为90.9%，与Zn2＋的螯合率为93.5%。WU Haohao，et al[28]以凤尾鱼Engraulis japonicus 肌肉蛋白为原料制备多肽亚铁螯合物，发现胰蛋白酶水解物具有最大的铁螯合活性，水解度和铁螯合条件对铁螯合活性有很大的影响。REN Zhangyan，et al[29]研究了以虾加工废弃物为原料制备多肽亚铁螯合物的酶解工艺，从6 种酶中筛选试验得出胰蛋白酶为最适酶，并利用响应面法优化得到最佳酶解工艺：酶添加量500 U·mL-1，pH 8.18，酶解时间120 min。李同刚等[30]以罗非鱼Oreochromis mossambicus 下脚料为原料，通过正交试验优化中性蛋白酶与风味蛋白酶的复合酶解条件，对酶解液进行超滤,比较不同超滤组分的螯合效果,发现在复合酶水解条件为温度55 ℃、加酶量1 500 U·g-1底物、双酶加酶量之比1∶2、料液比1∶4、自然pH 条件下时水解度为14.43%，酶解液的螯合率为77.92%，其超滤组分中，10 kDa 以下组分的螯合效果最好，螯合率达到89.36%，1 kDa 以下组分的螯合率较低为61.45%。何晨[31]通过单酶筛选，得出南极磷虾胰蛋白酶水解肽的金属离子结合能力最强，采用响应面分析最佳工艺条件：酶解时间为3 h，液料比为11.3∶1，酶添加量为3%，发现南极磷虾肽具有显著的金属离子（Zn2+、Fe2+、Zn2+）结合活性，并且与金属离子结合的能力：Ca2+＜Fe2+＜Zn2+，其中南极磷虾肽与Fe2+和Zn2+之间表现为特异性结合，而其与Ca2+之间的表现为非特异性结合。

2.4 降压肽

血管紧张素Ⅰ转化酶（ACE）可以将无活性的惰性前肽血管紧张素Ⅰ（ATⅠ）转化成具有很强升压作用的血管紧张素Ⅱ（ATⅡ），并促进血管舒缓激肽降解，从而导致血压升高，故可通过抑制血管紧张素转化酶的活性来发挥降血压作用，但常见的血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）（卡托普利、西拉普利、赖诺普利等）存在易诱发过敏等不良反应，限制了其临床应用，而研究发现食源性降压肽的作用更为温和、安全，近年来成为研究的热点[32-33]。

目前，从水产品中酶解提取降压肽也受到越来越多的关注，FAHMI，et al[34]用碱性蛋白酶酶解海鲷Sparus sarba 鱼鳞，发现其酶解产物ACE 抑制活性IC50值为0.57 mg·mL-1，采用色谱法分离出4 个具有高ACE 抑制活性的肽，其ACE 抑制活性是未纯化酶解产物的5～20 倍，4 条ACE 抑制肽的氨基酸序列分别为Gly-Tyr、Val-Tyr、Gly-Phe 和Val-Ile-Tyr。陈季旺等[35]研究发现所制备鱼降压肽经DA201-C 型大孔吸附树脂处理后其灰分由13.89%下降到3.89%，ACE 抑制活性由64.35%增到95.00%，脱盐后的鱼降压肽分子质量分布范围在200～7 000 Da 之间。张朋等[36]以血管紧张素转换酶（ACE）抑制率为指标，通过正交试验L9（34）确定碱性蛋白酶（alcalase）对金枪鱼Katsuwonus pelamis 碎肉蛋白的最佳酶解条件，利用D101 大孔树脂建立了酶解物的脱盐工艺，利用超滤、葡聚糖凝胶（G-25）色谱和反相-高效液相色谱（RP-HPLC）分离降压肽，并确定其纯度，利用氨基酸序列分析和ESI-MS 鉴定纯化多肽的结构。结果表明，碱性蛋白酶酶解金枪鱼碎肉蛋白制备降压肽的最佳酶解条件是：pH 9.5，酶用量1.5%，酶解温度50 ℃，酶解时间5 h；酶解物经超滤和Sephadex G-25 分离获得1 个纯度较高的四肽，经氨基酸序列分析和ESI-MS 鉴定结构为Phe-Gly-Gly-Val（FGGV）。经鉴定，利用碱性蛋白酶酶解并经超滤和色谱技术制备的金枪鱼碎肉蛋白降压肽具有良好的ACE 抑制活性。任艳等[37]通过建立体外测定ACE 抑制活性的分析方法，发现胰蛋白酶酶解南极磷虾蛋白制备ACE 抑制肽的最优条件为：初始pH 7.66，温度37.5 ℃，酶解时间5.05 h，加酶量0.15%（w/w），并通过超滤膜分离不同分子量片段，活性最强的ACE 抑制肽的分子量处于1～2 kDa 之间。王彦超等[38]发现南极磷虾经碱性蛋白酶和中性蛋白酶的酶解产物具有较好的ACE 抑制活性，IC50值为0.180 mg·mL-1和0.210 mg·mL-1。赵玉勤等[39]采用超滤和色谱法从南极磷虾蛋白水解物中分离出8 种降压肽，并通过测序确定了它们的结构，其中Trp-Phe 和Phe-Ala-Ser 对ACE 抑制作用的IC50值分别为0.32、0.15 mg·mL-1。此外，Trp-Phe、Tyr-Arg-Lys、Phe-Gln-Lys 和Phe-Ala-Ser 还可以增加人脐静脉内皮细胞（HUVEC）内一氧化氮（NO）浓度，降低培养基中内皮素-1（ET-1）的含量，纠正去甲肾上腺素诱导的内皮细胞功能障碍，并呈剂量依赖性相关。

2.5 免疫活性肽

免疫活性肽包括细胞因子,还有来源于植物和动物及微生物的免疫诱导肽，是指一类存在于生物体内具有免疫功能的多肽,可调节机体免疫功能，提高机体的免疫力[40]，以其相对分子低、活性强、用量少、稳定性强、生物活性高的独特优势，越来越多地引起人们的重视。

目前，通过酶解工艺从天然蛋白中获得免疫活性肽也逐渐成为当前食品和医药行业的研究热点。JOLLES，et al[41]首次利用胰蛋白酶水解人乳蛋白,从水解产物中分离得到一种免疫刺激肽。此外，许多研究表明乳蛋白酶解物及分离纯化后的短肽对人体免疫组织器官的生长发育和促进淋巴细胞的活性等方面有重要作用[42]。侯虎等[43]研究比较了各因素（温度、pH、吸附物浓度、料液比等）对树脂吸附鳕鱼排活性肽特性的影响。通过动态吸附与解析实验,探讨了DA201-C 树脂对鳕鱼排活性肽脱盐的可行性。结果表明，DA201-C 树脂对鳕鱼排活性肽吸附能力最强,在温度25 ℃、pH 4.0、溶液浓度10 mg·mL-1、料液比（树脂质量与活性肽体积比）2 g·mL-1的条件下,吸附率最高为84.7%。在动态吸附解析实验中，多肽的脱盐率为98.1%，回收率为90.3%.且脱盐后的多肽具有促进脾细胞增殖活性且呈现明显剂量依赖关系。徐恺等[44]采用木瓜蛋白酶（酶量为3 000 U·g-1）制备南极磷虾活性肽，相对分子质量＜10 000 Da。进一步实验发现通过连续给小鼠灌胃不同剂量南极磷虾活性肽28 d，发现小鼠的脾脏指数和胸腺指数、NK 细胞活性、抗体生成细胞数和血清溶血素等水平有明显提高，并且发现南极磷虾活性肽能够显著增加小鼠的存活时间、耗氧量和游泳时间；提高LDH、肝糖原含量、LA 清除率和肝脏、脾脏重量；降低LA 和BUN 含量，根据《保健食品功能学评价程序和检测方法》可以确定南极磷虾活性肽具有显著提高小鼠免疫力的功效[44]。

3 结语

南极磷虾资源无论在种类和数量上均极为丰富，然而到目前为止尚未得到充分与科学的开发，这就为人类更为充分利用南极磷虾资源，生产出更能满足人类需要的产品提供了新的机遇。随着人们对海洋生物资源开发认识地提高，以及现代生物技术在海洋活性肽等研究领域中的应用，相信在不久的将来，南极磷虾活性肽的开发与应用将为海洋资源综合利用开辟新的广阔的道路。