QuEChERS 结合气相色谱-质谱法同时测定果脯中16 种多环芳烃

苏 满，卢 劼，劳敏军，邓尚贵，祝世军，吴益春，周 勇，胡 艺，于 瑾

（1.浙江海洋大学食品与药学学院，浙江舟山 316022；2.浙江省农都农产品有限公司，浙江杭州 310004；3.浙江兴业集团有限公司，浙江舟山 316120；4.舟山市食品药品检验检测研究院，浙江舟山 316000；5.浙江恒和食品有限公司，浙江舟山 316000；6.龙游县养殖业发展中心，浙江龙游 324000）

多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs）是指含2 个或2 个以上苯环的芳烃，是一种持久性有机污染物，由于分子结构稳定，不容易被降解，这类化合物广泛存在于水、空气和土壤等环境中，且具有毒性、诱变性、致畸性和致癌性，APARNA,et al[1]发现苯并[a]芘在0.2 mg·L-1浓度水平会对斑马鱼Danio rerio 的神经系统造成伤害，导致学习和记忆的缺陷；LI Fang,et al[2]研究发现多环芳烃会导致小鼠肝细胞膜损伤，肝系统的炎症和紊乱。目前研究显示多环芳烃可以通过食物链传递至人体，对人类构成极大的健康风险[3]。

多环芳烃在土壤[4]和水环境[5-6]中的研究较多，蔬菜[7]、茶叶[8]、烟熏制品[9-10]、烧烤制品[11-12]中也被发现有多环芳烃的检出。不同样品有不同的基质和杂质，因此多环芳烃的检测方法并不互相适用。目前对于多环芳烃的检测主要分为前处理和检测分析两个部分，前处理又分为提取和净化两个部分。多环芳烃的前处理方法较多，QuEChERS 是近年来最新发展起来的一种前处理方法，该方法可灵活选用提取方式和净化方式，具有操作简单、方便快捷、高效绿色等特点[13]，在农残的检测中被广泛应用[14-15]。食品中对多环芳烃的检测方法有高效液相色谱[16-18]、液相色谱-质谱联用[19]、气相色谱[20]、气相色谱-质谱联用等方法[21-22]。果脯蜜饯广受欢迎，现在对于果脯中的多环芳烃残留问题和形成原因研究较少。本研究以果脯为研究对象，采用QuEChERS 作为前处理方法，优化前处理条件，结合气相色谱-质谱法，建立一种同时测定果脯中16 种多环芳烃的方法，为果脯中污染物的残留和形成原因提供基础支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

5 种常见果脯共40 份（市售）；16 种多环芳烃混合标准品：萘（NAP）、苊烯（ACY）、苊（ACE）、芴（FL）、菲（PHE）、蒽（ANT）、荧蒽（FLV）、芘（PYR）、苯并（a）蒽（BaA）（CHR）、苯并（b）荧蒽（BbF）、苯并（k）荧蒽（BkF）、苯并（a）芘（BaP）、茚（123-cd）芘（IND）、二苯并（ah）蒽（DBA）、苯并（ghi）苝（BghiP）（2 000 μg·mL-1，溶解于二氯甲烷，美国Accustandard 公司）；正己烷、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷（均为色谱纯国药集团）；30%过氧化氢、无水硫酸钠（均为分析纯国药集团）；2%硫酸钠溶液、经Milli-Q 净化的超纯水（实验室自制）。

1.2 仪器与设备

GM200 型粉碎研磨机（德国莱驰公司）；IKA/MS3 basic 型漩涡振荡器（德国IKA 公司）；HP-5MS 弹性石英毛细管柱（30 m×0.25 mm,0.25 μm）；7000D 气相色谱-三重四极杆质谱联用仪（美国安捷伦公司）；KQ-600DV 数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；Multi Reax 型多孔位振荡混合器（德国Heidolph 公司）；5804R 多功能冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；11155 型氮吹仪（美国Organomation）。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

提取：准确称取研磨打碎好的样品5 g 置于50 mL 离心管中，加入500 ng·mL-1的16 种多环芳烃标准品，加入2.5 mL 2%硫酸钠溶液、1 mL 30% H2O2和10 mL 乙腈，添加1 粒陶瓷均质子，再加入QuEChERs盐包（6 g MgSO4和1.5 g NaOAc），振荡提取3 min，超声提取30 min，4 ℃8 000 r·min-1离心5 min，取上清液待净化。

净化：将待净化液转移至15 mL QuEChERs 净化管（1 200 mg MgSO4和400 mg PSA）中，漩涡振荡1 min，加入2 g 无水硫酸钠，4 ℃8 000 r·min-1离心5 min，取上清液氮吹至尽干，用混合溶液（乙腈：正己烷=1：1）定容至1 mL，过0.22 μm 滤膜，上机待测。

1.3.2 标准溶液的配制

溶液标准曲线的配制：用移液枪准确吸取16 种PAHs 混合标准溶液0.1 mL，用二氯甲烷定容至10 mL，得到20 μg·mL-1的混合标准溶液；再用逐级稀释的方法，得到1、10、50、100、500、1 000 ng·mL-1的标准溶液，现用现配。

1.4 前处理条件的优化

影响多环芳烃提取效率的因素有提取溶剂、提取方式、提取时间及提取温度。

1.4.1 提取溶剂的选择

多环芳烃极性较弱，易溶于有机试剂，故此实验选取常用的有机试剂。考察正己烷、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷作为提取溶剂对果脯中16 种PAHs 回收率的影响，以确定最佳的提取试剂。按照1.3.1 方法进行样品前处理，按照1.5 方法进行测定。

1.4.2 提取方式的选择

常用的提取方式有漩涡提取、振荡提取、超声提取，使用1.4.1 确定的最佳提取试剂提取，考察漩涡提取、振荡提取、超声提取以及漩涡-超声提取对16 种多环芳烃回收率的影响，以确定最佳的提取方式。按照1.3.1方法进行样品前处理，按照1.5 方法进行测定。

1.4.3 提取时间的选择

以1.4.1、1.4.2 中确定的最佳提取条件，考察振荡3 min，超声10、20、30 和40 min 条件下对16 种PAHs回收率的影响，确定最佳的超声时间。按照1.3.1 方法进行样品前处理，按照1.5 方法进行测定。

1.4.4 提取温度的选择

以1.4.1、1.4.2、1.4.3 中确定的最佳提取条件，分别考察10、20、30 和40 ℃溶剂体积下对16 种PAHs回收率的影响，以确定的最佳提取温度。按照1.3.1 方法进行样品前处理，按照1.5 方法进行测定。

1.5 色谱质谱条件

1.5.1 色谱条件

色谱柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm,0.25 μm），反吹管：0.7 m×150 μm×0，色谱柱与反吹管连接，传输线温度280 ℃；进样量：1 μL；进样模式：不分流进样；色谱柱载气（He）流速：1.6 mL·min-1，恒定压力：135.1 kPa，到分流出口的吹气流量80 mL·min-1，吹扫0.75 min；升温程序：初始温度60 ℃保持1 min，以15 ℃·min-1升至110 ℃，保持1 min，以20 ℃·min-1升温至180 ℃，以2 ℃·min-1升温至203 ℃，以5 ℃·min-1升温至250 ℃，再以2 ℃·min-1升温至283 ℃，然后以20 ℃·min-1升温至310 ℃，保持3 min；反吹管载气（He）流速：3.3 mL·min-1，恒定压力：20.7 kPa。

1.5.2 质谱条件

离子源：电子轰击源，70 eV，离子源温度280 ℃，碰撞气（N2）流速：1.5 mL·min-1，淬灭气（He）2.25 mL·min-1，MRM 模式，16 种PAHs 离子对及碰撞能量见表1，色谱图如图1。

表1 16 种PAHs 离子对及能量Tab.1 16 PAHs ion pairs and collision energy

图1 16 种多环芳烃色谱图Fig.1 Chromatograms of 16 polycyclic aromatic hydrocarbons

2 结果与分析

2.1 提取条件的优化

2.1.1 提取溶剂的优化

由于多环芳烃的极性弱，化学性质比较稳定，常用有机试剂来提取，不同有机试剂提取效果不同。因此，本实验对比了乙腈、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷4 种有机试剂对果脯中16 种PAHs 的提取效果。实验表明，4 种试剂均能提取PAHs，正己烷的平均回收率为79.1%，乙腈的回收率为86.9%，二氯甲烷的回收率为64.8%，三氯甲烷的回收率为71.5%。果脯在工业加工后仍含有部分水，乙腈与水互溶，能与均浆后的样品充分反应，且提取效率好于正己烷；二氯甲烷、三氯甲烷毒性较大，极易挥发，综合考虑，本实验选用乙腈作为萃取溶剂。

2.1.2 提取方式的选择

常见的前处理提取方式有漩涡、振荡、超声等，本实验考察了这3 种提取方式与振荡-超声结合提取对PAHs 回收率的影响如图3，平均回收率分别为42.4%、49.8%、79.3%和86.2%。结果表明，漩涡振荡-超声提取效果最好。振荡可使溶剂与基质充分混合，超声会促使果肉细胞组织的破壁或变形，使提取更加充分，且超声适用性强，提取条件简单，因此本实验选择振荡-超声法提取多环芳烃。

图2 不同溶剂提取下PAHs 的平均回收率Fig.2 Average recovery rate of PAHs under different solvent extraction

图3 不同提取方式下PAHs 的平均回收率Fig.3 Average recovery rate of PAHs under different extraction methods

2.1.3 提取时间的选择

不同超声时间提取对多环芳烃的平均回收率如图4 所示，本实验对比了10、20、30 和40 min 超声时间提取下，平均回收率分别为77.1%、82.2%、86.7%和84.7%。结果表明，超声提取时间为30 min 时提取效果最好。随着超声时间的增加，平均回收率呈现出先上升后下降的趋势，可能是超声时间过长，使样品杂质流出，影响提取效率。因此，本研究选用超声30 min 作为最佳超声时间。

图4 不同超声时间提取下PAHs 的平均回收率Fig.4 Average recovery rate of PAHs under different ultrasonic time extraction

2.1.4 提取温度的选择

本研究对比了4 个超声提取温度对PAHs 的平均回收率如图5 所示，实验结果表明，在10 ℃时，平均回收率为81.9%；20 ℃时回收率为86.4%，30 ℃时回收率为85.8%，40 ℃时回收率为83.6%；20、30 ℃时回收率相差不大，10 ℃时回收率略低可能是因为温度较低影响了对基质的超声效果，40 ℃时，回收率下降可能是温度升高，部分目标物在提取过程中转移到空气中[23]。

图5 不同超声温度提取下PAHs 的平均回收率Fig.5 Average recovery rate of PAHs under different ultrasonic temperature extraction

2.2 方法的线性范围与检出限

溶液标准曲线的配制：用移液枪准确吸取16 种PAHs 混合标准溶液0.1 mL，用二氯甲烷定容至10 mL，得到20 μg·mL-1的混合标准溶液；再用逐级稀释的方法，得到1、10、50、100、500、1 000 ng·mL-1的标准溶液，现用现配。

按照1.3.2 方法分别配制浓度为1、10、50、100、500、1 000 ng·mL-1的标准溶液，以目标物对应的质量浓度为横坐标，以目标物对应的离子峰面积为纵坐标，建立线性回归方程并分析。按样品5 g，定容1 mL，以信噪比（S/N）为3 计算出检出限（LOD），以信噪比（S/N）为7 计算出限定（LOQ），结果表明16 种目标化合物多环芳烃在1～1 000 ng·mL-1范围内均呈现出良好的线性关系，相关系数（r）在0.998 0～0.999 9 范围内，检出限为0.43 ng·mL-1，定量限为1 ng·mL-1（表2）。该方法适用于果脯中16 种多环芳烃的同时检测。

表2 16 种PAHs 线性方程及检出限、定量限Tab.2 16 kinds of PAHs linear equations and detection limit,quantification limit

2.3 方法的回收率与精密度

对果干样品进行加标回收实验，样品在1、10、200 μg·kg-13 个水平的加标回收率分别为79.8%～104.1%、78.3%～103.6%、80.1%～104.3%，相对标准偏差RSD 分别为1.9%～6.4%、1.5%～4.9%、1.4%～4.2%，结果表明方法的准确度和精密度符合污染物残留的分析检测要求（表3）。

表3 16 种PAHs 平均加标回收率及相对标准偏差Tab.3 The average recovery rate and relative standard deviation of 16 PAHs

2.4 实际样品检测

采用本实验建立的方法，对市售40 份果脯样品进行检测，其中萘、苊、菲、荧蒽、芘、苯并（a）蒽、苯并（ghi）苝有检出；苊烯、芴、蒽、、苯并（b）荧蒽、苯并（k）荧蒽、苯并（a）芘、茚（123-cd）芘、二苯并（ah）蒽、苯并（ghi）苝未有检出。

如表4 所示，其中PAHs 总量超过15 μg·kg-1的有5 个样品，5 个样品中苊的平均检出量为16.13 μg·kg-1，应当引起重视。图6～10 分别为样品A、B、C、D、E 为色谱图。

图6 样品A 中多环芳烃色谱图Fig.6 Chromatogram of PAHs in sample A

表4 PAHs 检出量过高样品（μg·kg-1）Tab.4 Samples with too high PAHs detection

图7 样品B 中多环芳烃色谱图Fig.7 Chromatogram of PAHs in sample B

图8 样品C 中多环芳烃色谱图Fig.8 Chromatogram of PAHs in sample C

图9 样品D 中多环芳烃色谱图Fig.9 Chromatogram of PAHs in sample D

图10 样品E 中多环芳烃色谱图Fig.10 Chromatogram of PAHs in sample E

3 结论

本文采用QuEChERS 法结合气相色谱-质谱法建立了同时测定果脯中16 种PAHs 的方法，通过对前处理条件的优化，实现了果脯中16 种PAHs 的精准定量和分析，能够较好得在实际样品检测中应用。该方法中16 种PAHs 浓度在1～1 000 μg·kg-1之间线性关系良好，3 个浓度水平加标回收率为78.3%～104.3%，相对标准偏差为1.4%～6.4%之间（n=6），方法的检出限为0.43 ng·mL-1，定量限为1 ng·mL-1，该方法操作简单、灵敏度高，能够满足日常检测分析要求，适合大批量样品处理。