外泌体在结肠癌和成纤维细胞间交互影响中的作用研究进展

尹贻倩，陈艺文，赵雨雪，贾晓楠，韩月，邹晨，茅凌翔，许化溪

(1. 江苏大学附属人民医院检验科，江苏 镇江212002； 2. 江苏大学医学院，江苏 镇江212013； 3. 江苏大学附属人民医院胃肠外科，江苏 镇江212002)

结肠癌是由于癌基因或者抑癌基因遗传或表观遗传突变导致，发病率位居第3的消化道恶性肿瘤[1-2]，全球每年约有120万新诊断病例，每年报告的死亡人数为70万[3]。据预测，到2035年全球因结肠癌死亡的人数将增加60%[4]。结肠癌治疗以手术治疗和化疗放疗为主，但仍有40%的结肠癌患者死于肿瘤的转移和复发。

19世纪80年代，研究者们提出“种子-土壤”假说来形容肿瘤与肿瘤微环境的关系。肿瘤微环境由间质细胞和基质液组成，其中成纤维细胞是肿瘤间质中数量最丰富的细胞类型，影响肿瘤的发生、发展和转移。肿瘤细胞也可以通过多种途径，作用于微环境中的间质细胞。外泌体是细胞分泌的膜性囊泡结构，其内容物包含蛋白质、脂质和核酸等生物活性分子，是结肠癌细胞和成纤维细胞间交互影响的重要媒介，本文就外泌体在结肠癌细胞和成纤维细胞间交互影响的作用及其机制作一综述。

1 成纤维细胞

肿瘤微环境中的间质细胞主要包括成纤维细胞、内皮细胞、周皮细胞等，在实体恶性肿瘤中，成纤维细胞可被激活为肿瘤相关成纤维细胞(cancer associated fibroblast，CAF)，其占据间质细胞总数的50%。CAF形态为长梭形，其增殖能力、蛋白合成能力及细胞周期活性均明显高于正常成纤维细胞。CAF具有高度异质性，有多种不同表型和功能的亚型，通常根据不同的标志物来辨别，包括α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，纤维连接蛋白(fibroblast activating protein，FAP)，血小板衍生生长因子受体β(platelet-derived growth factor receptor beta，PDGFRβ)，纤维特异性蛋白(fibroblast-specific protein 1，FSP1 或 S100A4)，小窝蛋白-1(caveolin-1，CAV-1)，CD29[5]和细胞表面蛋白CD10，G蛋白偶联受体7和CD146[6]等。

CAF可通过多种方式影响肿瘤的发生发展。CAF借助合成和降解成分来改变胞外基质，并通过交联酶、蛋白酶重塑其结构，建立肿瘤的安全屏障； CAF还通过分泌可溶性介质直接促进肿瘤细胞增殖和生存、促进血管生成。此外，CAF还能发挥负向免疫调节作用，助力肿瘤逃避免疫监视。

2 外泌体

外泌体是一类直径为30～150 nm的脂质双分子层囊泡，包裹多种蛋白质、脂质、核酸和其他代谢物，可以被大多数类型细胞分泌，并且广泛存在于尿液、乳液、泪液、脑脊液等体液中[7]。外泌体的形成包括两个步骤，一是早期核内体膜内陷形成腔内囊泡(intraluminal vesicles，ILVs)，然后成熟为晚期核内体即多泡体(multivesicular bodies，MVBs)；二是MVBs与质膜融合后，将腔内囊泡释放到胞外，即外泌体。外泌体可以参与多种生理活动，包括细胞间通讯、哺乳动物繁殖和免疫调节等，并在心血管疾病、神经变性和癌症等疾病的病理进展中起重要作用。近年来，外泌体在肿瘤细胞与成纤维细胞之间的通讯作用成为研究热点。

3 结肠癌来源的外泌体对成纤维细胞的影响

3.1 激活成纤维细胞

结肠癌源性外泌体对成纤维细胞的影响主要分为两方面，一是激活成纤维细胞为CAF，二是使成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，两者均能有效地促进结肠癌的发生、发展。结肠癌来源的外泌体中miRNA-10b可直接靶向基质中正常成纤维细胞中的磷脂酰肌醇激酶3催化亚单位(PIK3CA)，降低PI3K/Akt/mTOR信号通路活性，促进成纤维细胞TGF-β 和α-SMA的表达，从而使其激活为CAF，利于肿瘤的发生发展[8]。Rai 等[9]研究发现，将原发性结肠癌细胞SW480和转移性结肠癌细胞SW620分泌的外泌体分别加入静止的正常成纤维细胞上清液中，成纤维细胞的α-SMA表达显著增强，基质重塑能力增强，激活为CAF；其中，SW480来源的外泌体激活后的CAF具有高度促进肿瘤增殖和促血管生成的能力，SW620来源的外泌体激活后的CAF具有促肿瘤侵袭的能力。结肠炎可发展为结肠癌，利用右旋糖酐硫酸钠诱导小鼠结肠炎后，发现结肠癌细胞分泌的胞外囊泡中表皮生长因子能够激活成纤维细胞，从而利于结肠癌的发展[10]。抑癌基因p53缺失的结肠癌细胞HCT116来源的外泌体携带过量miRNA-4534，通过抑制成纤维细胞自噬相关蛋白2B(autophagy-related 2B，ATG2B)的表达，激活成纤维细胞，从而加速成纤维细胞介导的癌细胞增殖[11]。肌成纤维细胞是一种呈现为激活状态的成纤维样细胞，以α-SMA的表达为特征。在实体癌中，富含肌成纤维细胞的微环境可以支持肿瘤生长、转移和血管生成。研究发现，结肠癌细胞系Caco-2通过外泌体中TGF-β刺激正常成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，表明结肠癌来源的外泌体是激活成纤维细胞的重要参与者[12]。

3.2 促进成纤维细胞的增殖和迁移

2009年，研究者对人结肠癌细胞SW480进行了细胞转录组分析，并首次鉴定出11 327个参与肿瘤发生相关过程的mRNA，其中有241种mRNA富集于结肠癌细胞来源的外泌体中，27种参与了细胞周期相关的活动[13]，关于这些分子在成纤维细胞中发挥的作用需要后续实验研究。ΔNp73mRNA(p73基因的异构体)与致癌潜能相关，可以被包裹在结肠癌细胞分泌的外泌体中，促进其他结肠癌细胞以及基质中的成纤维细胞、内皮细胞的增殖。并且，外泌体ΔNp73mRNA存在于结肠癌患者的血清中，可作为预后判断的标志物[14-15]。癌源性外泌体中miRNA被认为是细胞恶化的诱因，通过影响肿瘤微环境中的血管生成、基质细胞增殖、迁移从而促进肿瘤的发生。结肠癌细胞分泌的外泌体携带一些miRNAs(miRNA-1249-5p，miRNA-6737-5p和miRNA-6819-5p)，抑制成纤维细胞中的抑癌基因p53的表达，从而促进肿瘤的发展[16]。结肠癌细胞HT-29和SW480来源外泌体中的miRNA-let-7d能够下调CAF中趋化蛋白(CCL7)的表达，抑制其抗肿瘤免疫反应，从而促进结肠癌的增殖、迁移和侵袭[17]。丁酸钠诱导分化的人结肠癌细胞HT-29分泌大量的含CD133的外泌体，能够促进人结肠癌细胞HCT116和大鼠正常成纤维细胞Rat-1的增殖和迁移[18]。

4 成纤维细胞来源的外泌体对结肠癌细胞的影响

4.1 提高结肠癌细胞的耐药性

5-氟尿嘧啶、奥沙利铂和氨甲蝶呤是治疗结肠癌常用的化疗药物，但是大多数患者会出现固有和获得性耐药，其中位生存期只有20个月左右。因此，关于结肠癌耐药性机制的问题亟待解决。Hu等[19]将结肠成纤维细胞系(CCD-18Co)和CAF分泌的外泌体分别加入体外培养的结肠癌细胞系SW620衍生和体内分离的肿瘤干细胞中，发现成纤维细胞来源的外泌体能够增加肿瘤干细胞对5-氟尿嘧啶和奥沙利铂的耐药性。进一步的研究表明，CAF来源的外泌体能通过Wnt信号通路增加肿瘤干细胞的百分比，促进集落形成和肿瘤生长，从而提高肿瘤细胞的耐药性。

miRNA是一类具有18～22个核苷酸的单链非编码RNA，可被包裹在外泌体中参与细胞的增殖、分化、代谢和凋亡。CAF利用外泌体转运miRNA-92a-3p至结肠癌细胞，而高水平的miRNA-92a-3p通过直接抑制靶基因F框/WD40域蛋白7(F-Box and WD40 domain protein 7，FBXW7)和凋亡调节因子1(modulator of apoptosis 1，MOAP1)，激活Wnt/β-catenin通路，从而抑制线粒体凋亡，促进了结肠癌细胞的干性、间质-上皮转化、转移和对5-氟尿嘧啶的耐药[20]。研究报道，CAF来源外泌体中的miRNA-24-3p可通过结肠癌细胞中尾型同源盒转录因子2/膜铁转运辅助蛋白(CDX2/HEPH)轴，抑制细胞凋亡和促进肿瘤生长，并且增强结肠癌细胞对甲氨蝶呤的耐药；而转染miRNA-24-3p抑制子的CAF来源的外泌体能够降低结肠癌细胞的活力和集落形成，增加细胞凋亡，抑制体内肿瘤生长，这为提高氨甲蝶呤在临床结肠癌治疗中的敏感性提供一个潜在靶点[21]。近年来，放射治疗被认为是减少局部复发的标准术前治疗方法，可促进细胞凋亡。然而，结肠癌细胞对放疗产生的耐药性成为减少结肠癌细胞死亡的主要障碍。放疗情况下，CAF分泌的外泌体中含有高水平的miRNA-93-5p，与结肠癌细胞SW480共孵育后，结肠癌细胞的增殖能力和克隆形成能力加强。它的可能调控机制为miRNA-93-5p在结肠癌细胞内通过抑制叉头框蛋白A1(FOXA1)的表达激活TGF-β信号通路，从而抑制结肠癌细胞的凋亡，增强其对放疗的抵抗性[22]。相似地，CAF来源的外泌体中miRNA-590-3p能在结肠癌细胞中抑制其靶基因氯化物通道附件4(CLCA4)，从而激活CLCA4原本抑制的PI3K/Akt信号通路，调节DNA损伤应答反应，抑制细胞凋亡，增强结肠癌细胞SW620和HCT116对放疗的抵抗力[23]。

长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA，通过与DNA、染色体、蛋白质等大分子物质作用，调控细胞的生命活动。CAF通过释放含有高水平lncRNA H19的外泌体，作用于miRNA-41激活结肠癌细胞的Wnt/β-catenin信号途径，以提高其对奥沙利铂的耐药性和促进其干性[24]。结肠癌相关lncRNA(CCAL)可以通过外泌体从CAF转移到结肠癌细胞，与mRNA结合蛋白HuR相互作用，激活β-catenin信号通路，提高结肠癌细胞对奥沙利铂和5-氟尿嘧啶的抵抗性[25]。

4.2 促进结肠癌的转移和进展

癌细胞转移是一个多步骤、多阶段、多基因调控的过程，涉及癌细胞从原发部位逃逸、缺乏免疫监视和肿瘤微环境的协同作用，是结肠癌患者死亡的主要原因。研究者们从结肠癌组织及癌旁组织分别分离出CAF和成纤维细胞，并对它们分泌的外泌体进行miRNA微阵列分析，发现CAF来源的外泌体中miRNA-21丰度最高，且利用结肠原位癌模型证明miRNA-21可通过其外泌体传递给结肠癌细胞，促进结肠癌的转移[26]。Zhang等[27]研究表明CAF来源的外泌体将miRNA-17-5p传递给结肠癌细胞，调控RUNX家族转录因子3 (RUNX3)信号轴以激活TGF-β1途径，促进结肠癌的转移。随后，大量的TGF-β1被分泌到胞外基质中，反过来激活成纤维细胞，由此形成促进结肠癌转移的正反馈。研究表明miRNA-135b-5p经CAF源性外泌体传递到结肠癌细胞，通过下调细胞中硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)表达，促进结肠癌细胞增殖、迁移、侵袭和血管生成[28]。

Linc00659是一种lncRNA，已被鉴定为一种新型癌基因，其在结肠癌中的表达水平显著升高。研究发现Linc00659经CAF源性外泌体传递到结肠癌细胞Lovo和SW480中，通过抑制miRNA-342-3p上调膜联蛋白A2(annexin A2，ANXA2)的表达，最终促进结肠癌细胞增殖、侵袭、迁移和间质-上皮转化[29]。

此外，CAF来源的胞外囊泡能够携带表皮生长因子家族成员双调蛋白，促进结肠癌细胞增殖，但是其具体的作用机制未知[30]。

5 外泌体作为结肠癌诊断和预后的标志物

外泌体在结肠癌与成纤维细胞的交流中发挥信使功能，其运输的货物与其亲本细胞有一定的相关性，可以作为判断疾病进展的标志物。研究者们收集88例结肠癌患者和12例健康者的结肠组织样本，对所有外泌体进行miRNA微阵列分析后发现，相比于健康者的结肠组织，7种miRNAs(let-7a、miRNA-1229、miRNA-1246、miRNA-150、miRNA-21、miRNA-223和miRNA-23a)在结肠癌患者组织来源的外泌体中表达量较高，或可作为结肠癌早期诊断的标志物[31]。Bahnassy等[32]比较了124例结肠癌Ⅱ期患者和100例健康者结肠组织中miRNA的表达量，发现miRNA-21、Let-7a-5p、miRNA-100-5p、miRNA-200c-3p和miRNA-23b-3p可作为Ⅱ期结直肠癌常用的诊断标志物，miRNA-21、miRNA-498和miRNA-320可以预测结肠癌的复发和患者的生存。这些miRNAs是否也存在于结肠癌组织来源的外泌体中，用于结肠癌的诊断标志物还需进一步探究。另有研究通过二代测序技术对CAF和成纤维细胞及其分泌的外泌体中的非编码RNA进行了检测和生物信息学分析，其中miRNA-6087 和miRNA-AL353644.1在CAF来源的外泌体中含量更高，并且可能作为结肠癌发生、发展的诊断标志物[33]。

Mathivanan等[34]利用免疫捕获法分离结肠癌细胞系LIM1215来源的外泌体，发现了多种具有组织特异性的蛋白，如A33、钙黏蛋白-17(cadherin-17)、闭合蛋白1(claudin 1)等，可能作为结肠癌诊断的标志物。但是由于当时外泌体的分离、纯化、鉴定方法不完善，获得数据的准确性和实用性降低，需要进一步探究。结肠癌细胞来源外泌体中干扰素调节因子-2(interferon regulatory factor-2，IRF-2)被巨噬细胞吸收，促进淋巴管的生成，可用于预测结肠癌的转移情况[35]。Ganig等[36]发现，静息硫基氧化酶1(quiescin sulfhydryl oxidase 1，QSOX1)蛋白含量在结肠癌患者的血浆以及成纤维细胞分泌的外泌体中显著下降，因而认为QSOX1是一种有前途的结肠癌早期诊断和无创风险分层的新标志物。除此之外，有研究报道二萜内酯化合物(ovatodiolide)可以通过降低结肠癌细胞分泌的外泌体中β-catenin/STAT3/miRNA-1246的含量，抑制肿瘤干细胞的形成和恶性间质-上皮的转化，为治疗癌症提供了临床前证据[37]。外泌体包裹的这些物质可以作为预测结肠癌发展的标志物，但不是诊断的金标准，其特异性还需大量研究验证。

6 结语

结肠癌和成纤维细胞释放的外泌体在原发性肿瘤微环境中对调节癌症进展起重要作用。成纤维细胞来源的外泌体参与驱动机制，促进肿瘤生长、迁移、转移和耐药性；结肠癌细胞来源的外泌体能更好地调控成纤维细胞，使之更好地辅助肿瘤细胞。结肠癌细胞以及成纤维细胞分泌的外泌体中包裹的miRNA、蛋白等可作为辅助诊断结肠癌转移、耐药、预后等的生物标志物，具有潜在的临床应用价值。