蛋白激酶B通路、乙酰肝素酶、NADPH氧化酶在心肌缺血再灌注损伤中的作用及相互关系的研究进展

尹惠阳，蔺雪峰，韩轩茂

(1. 内蒙古科技大学包头医学院 研究生学院，内蒙古 包头 014060；2. 内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院 心内一科，内蒙古 包头 014010)

缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury，IRI)是因血管部分或全部闭塞引起组织缺血缺氧，血液再通后，分子氧突然向缺血组织再分布并进一步损害缺血组织及周围组织的一种独特损伤反应[1]。IRI的病理生理机制是目前研究的热点[2]。常见的急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是冠状动脉粥样硬化性心脏病的一种严重类型，其发病率和死亡率均较高。AMI最有效的治疗方法是通过溶栓、血管成形术和冠状动脉搭桥术等手段使缺血心肌血运重建，但是心肌IRI可引起诸多并发症。研究发现，在缺血/再灌注过程中，蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)、乙酰肝素酶(heparanase，HPSE)及NADPH氧化酶(NADPH oxidase，Nox)不同程度地表达，并且相互作用，可能引起细胞凋亡，导致IRI[3-5]。

1 Akt、HPSE、Nox在IRI中的作用

1.1Akt在IRI中的作用 Akt是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，已知3种亚型，分别为Akt1，Akt2及Akt3。Akt1和Akt3广泛表达，而Akt2在胰岛素敏感组织如棕色脂肪、骨骼肌和肝脏中表达，它们在心血管系统中发挥多种作用[6]。Akt作为多种细胞功能的调节剂，主要通过组成PI3K/Akt信号通路来发挥作用[7]。PI3K/Akt信号通路涉及多种生理病理过程，参与细胞生长、代谢及肿瘤增殖侵袭等过程[8]。既往研究表明，细胞凋亡在IRI中起重要作用[9]。PI3K/Akt信号通路通过调节相关分子的表达来调节细胞凋亡，在细胞凋亡、血管生成、血管舒张、新陈代谢等方面起重要作用[10]。

研究表明，在IRI过程中Akt作用于不同的下游因子来发挥不同生物学效应。Sulaiman等[11]实验证明，激活PI3K/Akt/GSK-3 RISK通路可以减轻心肌细胞的线粒体功能障碍，减轻心肌IRI。缺血/再灌注时，血管平滑肌细胞分泌重组人成纤维细胞生长因子，激活PI3K/Akt通路，Akt通过激活雷帕霉素复合物1(mammalian target of rapamycin C1，mTORC1)，引起参与细胞增殖的各种mTORC1底物磷酸化，调节细胞生长和增殖。mTORC1的活化使缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)蛋白水平增加，进一步增加血管内皮生长因子的分泌，导致血管形成和内皮细胞迁移[12]。同时，Akt抑制叉头框蛋白O3a和糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)等下游因子[13]，使线粒体通透性转换孔减少，稳定缺血/再灌注细胞中的线粒体膜电位，增加平滑肌细胞的增殖[14-15]。Akt还可以磷酸化内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)，eNOS在由生长因子和血管紧张素诱导的血管生成和血管通透性中起主要作用，其产生的NO具有血管舒张、保护心脏的作用[16]。

1.2HPSE在IRI中的作用 HPSE是唯一一种具有降解硫酸乙酰肝素(heparan sulfide，HS)能力的内-β-葡萄糖醛酸酶，广泛存在于多种细胞的细胞表面和细胞外基质中。HPSE酶促活性为催化切割HS蛋白的聚糖侧链，有助于细胞外基质和基底膜的重塑并促进与HS连接的生长因子、细胞因子、酶等分子的释放。HPSE还通过与跨膜蛋白的相互作用来触发不同信号通路，发挥其非酶促作用[17]。病理情况下，如缺血/再灌注、肿瘤进展和转移、炎症和纤维化，HPSE过表达[18]。

Masola等[19]研究发现，肾脏IRI时，肾小管和肾小球的HPSE增加，诱导肾小管细胞凋亡和巨噬细胞向M1极化，促进单核细胞活化，同时HPSE过表达触发HS降解发挥其酶促活性，并调节多配体蛋白聚糖1(syndecan-1，SDC1)表达，HPSE与SDC1相互作用，诱导碱性成纤维细胞生长因子通过PI3K/Akt通路引起部分近端肾小管上皮细胞向成肌纤维细胞的上皮-间质转化。HPSE调节肾小管上皮细胞促炎因子表达，引起炎症反应，造成组织损伤，诱导肾小管细胞死亡，促进纤维化[20]。

1.3Nox在IRI中的作用 活性氧(reactive oxygen species，ROS)可调节多种氧化还原依赖性信号通路。而Nox是ROS生成所必需的酶，是细胞分化、生长、增殖及各种机制的重要调节剂[21]。在哺乳动物中，目前已知有7种Nox同工型，分别为Nox 1～5、Duox 1和Duox 2[22]。其中，Nox2和Nox4在干细胞和心肌细胞中大量表达，是心脏缺血/再灌注过程中产生ROS的主要来源，在心脏损伤和重塑的发展中起着至关重要的作用[23-24]。Nox的主要作用是产生ROS参与氧化应激[25]。ROS的产生和抗氧化防御系统处于动态平衡，低水平的ROS可以启动细胞内信号转导，调节细胞功能，对心脏起保护作用[26]。但心血管危险因素造成ROS产生过多，超过抗氧化防御系统的调节，将会导致氧化应激，进一步引起内皮细胞活化和巨噬细胞浸润，抑制内皮细胞产生NO，促进动脉粥样硬化，参与细胞增殖、迁移及分化，进一步加重血管疾病[27-28]。

Nox亚型在介导缺血再灌注后的氧化应激和心肌损伤中起重要作用，抑制Nox活性可有效防止ROS过度产生。研究表明，Nox2和Nox4在缺血/再灌注时表达上调，产生超氧阴离子，在酶作用下转化为H2O2[29]。超氧化物通过阴离子通道孔隙，导致NO降解、过氧亚硝酸盐形成和蛋白质酪氨酸硝化等。H2O2通过与过氧化物酶反应，使酪氨酸磷酸酶等失活，引起细胞毒性。Nox在缺血和再灌注过程中均有参与，HIF-1α促进Nox的活化，而氧化应激进一步增加HIF-1α的产生，形成正反馈，加重损伤。此外，再灌注后细胞还释放磷脂酶A2、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β和血管紧张素II等介质来激活Nox产生ROS[30]。ROS可能导致炎细胞积聚，产生细胞因子，进一步促进Nox过表达，从而引起心脏、脑、胃肠等多种器官的再灌注损伤[5]。

2 Akt、HPSE、Nox在IRI中的相互作用

2.1HPSE介导PI3K/Akt通路 多项研究表明，HPSE可激活多种信号传导途径，调节多种细胞功能，其中HPSE诱导PI3K/Akt通路并增强Akt磷酸化最为常见。Ben-Zaken等[31]研究表明，HPSE对Akt/PKB的激活是由脂质筏介导的。脂质筏可能通过与整合素αVβ3和α5β1结合，并将其激活。黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)家族包括FAK和富脯氨酸蛋白酪氨酸激酶2(proline-rich tyrosine kinase 2，PYK2)。整合素招募FAK和PYK2，诱导FAK在Tyr-397处及PYK2在Tyr-402处的自我磷酸化[32]。活化的FAK、PYK2与PI3K的p85亚基结合，使p85亚基活化，p85亚基激活PI3K的p110α亚基，引起PI3K磷酸化，导致磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate，PIP2)磷酸化为3、4、5-三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol-3, 4, 5-trisphosphate，PIP3)，PI3K与Ras结合结构域(RAS)相互作用促进了Akt磷酸化。Thr-308位点和Ser-473位点是Akt磷酸化最重要的位点。Riaz等[33]研究发现，HPSE介导Akt的Ser-473位点磷酸化，PIP3激活mTORC2并结合Akt，导致Akt的Thr-308位点部分激活，mTORC2引起Akt的Ser-473位点完全磷酸化，造成Akt磷酸化。

2.2Akt与Nox的相互促进作用 PI3K/Akt通路的下游因子约有100多种蛋白质，作用于不同的下游因子引发不同的生物学效应。Nox是产生ROS引发氧化应激的主要物质，Nox与Akt之间相互作用，但是它们之间确切的上下游关系存在争议。

已有多项研究表明，Akt促进Nox激活和ROS产生[34-40]。Nakanishi等[34]研究发现，PI3K/Akt和蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)激活处于同一路径，位于细胞膜去极化的下游，但在Nox激活的上游。PKC抑制剂与PI3K抑制剂作用相当，两种抑制剂的共同作用并不强于单独使用，说明PI3K和PKC存在于相同的通路内。Cai等[35]研究提示，PKC-δ可能作为Akt的上游起作用，参与Nox合成的调节。在非吞噬细胞中，PI3K/Akt通路激活后，Akt通过磷酸化S304和S328位点上的p47-phox，引起p47-phox磷酸化，通过将p47-phox和Rac-1从胞质转移到细胞膜上来组装膜Nox复合物，从而激活Nox[36-37]。Nox活化后，Nox通过与分子氧和NADPH的氧化还原反应产生超氧阴离子，将其还原为H2O2，Nox相关的胞质蛋白与完整的膜亚基结合形成功能性酶，从而产生ROS[38]。Nox组装和ROS过度产生除引起氧化应激导致细胞死亡外，还会引起大量钙内流和血管收缩，导致血压升压[39-40]。

2.3Nox促进PI3K/Akt通路激活 Nox和ROS主要通过诱导10号染色体上缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)降解、抑制蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)以及调节蛋白质酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase，PTP)来激活PI3K/Akt通路。脂质可通过上调PTEN导致PIP3被磷酸化还原为PIP2，从而抑制PI3K/Akt信号通路，而过度的氧化应激可以抑制负调控因子PTEN的活性来激活PI3K/Akt信号传导[34]。Nox导致氧化应激和H2O2产生增多，暴露于H2O2环境中的PTEN会失活，从而激活PI3K/Akt信号通路[41]。在缺氧H9C2细胞和原代心肌细胞中，Nox4促进Akt磷酸化；PP2A通过丝氨酸473和苏氨酸308位点对Akt进行去磷酸化[42]。而Nox4可导致Src激酶激活，氧化半胱氨酸残基上的PP2A，并下调PP2A活性，抑制Akt通路的负向调控，从而导致Akt活性增强[43]。ROS还可通过PTP调节PI3K/Akt信号传导[36]。另外，还有研究表明，Nox4还可通过激活Akt/mTOR和NFκB信号通路来诱导心肌肥大及纤维化，抑制Nox4可能是治疗心脏重塑的潜在方法[44]。

3 小结与展望

综上所述，Akt作为多种细胞功能的调节剂，受到多种上游因子及下游因子的调控，作用于不同因子，显现出不同的作用。在IRI中，Akt对损伤的调节也是多方面的。Akt主要通过增强mTORC1、eNOS、GSK3β等下游因子来起到保护心脏作用。同时，还可以通过激活Nox引起氧化应激，造成细胞损伤。现有研究提示，HPSE、Akt、Nox均参与IRI，并且相互影响。由于HPSE与Nox拥有共同的信号通路(PI3K/Akt通路)，我们推测PI3K/Akt可能是HPSE和Nox4间的中介物质，因此HPSE对Nox的调控仍值得关注。HPSE与Nox之间的相互作用及Akt是否起到核心中介作用有待进一步深入研究。心肌IRI中，HPSE是否通过PI3K/Akt信号通路，调控缺血/再灌注心肌细胞Nox的表达，诱导心肌细胞凋亡的作用机制的相关研究十分匮乏，需要进一步研究发掘。