22种中药多糖对猪源大肠杆菌的体外抑菌活性研究

尹 苗，周艳美，陈希文*，王 聪，吴 倩，赵 洪

(1.绵阳师范学院动物疫病防控与健康养殖工程技术研究中心，四川绵阳 621000；2.四川生猪重大疫病监测与防控工程研究中心，四川绵阳 621000)

0 引言

大肠杆菌病是严重危害当前畜禽业健康发展的细菌病之一，可以引起仔猪黄白痢和水肿病等，长期以来其防治主要依靠抗生素.但由于大肠杆菌易产生耐药性，其耐药质粒也能够在人和动物之间传播，给人类健康和公共卫生安全造成了严重危害[1].同时，近年来超级大肠杆菌和多重耐药菌株的出现，引起了世界的广泛关注，多国纷纷制定政策禁止在养殖过程中长期使用抗生素.根据2019年7月9日农业农村部第194号公告部署，从2020年7月起停止生产、进口加工和使用部分药物为饲料添加剂，以维护动物源食品安全和公共卫生安全[2].因此，寻找抗生素替代品保障畜牧业健康持续发展已迫在眉睫.中药因其具有营养、保健、促生长以及无残留和不易产生耐药性等特点，已逐渐被国内外研究者重视，研究发现中药及中药提取物对很多致病菌具有较强的抑制作用，有望成为抗生素的替代药物或辅助药物[3-5].同时，随着社会对食品安全及无抗养殖的重视和关注，筛选对致病菌敏感、高效、低毒和低残留的中药来防控动物疾病已经成为当前兽医工作者研究的热点和趋势，也是发展绿色健康高效无抗养殖急需解决的一个重要课题.本研究选择多糖含量较高的22种中药，采用超声波辅助法提取其多糖化合物，研究其对猪源大肠杆菌的体外抑菌活性，以期为兽医临床合理用药、有效防控大肠杆菌病提供科学依据.

1材料与方法

1.1 中药材

22种常用中药材地榆、黄芪、大黄、虎杖、丹参、黄连、柴胡、鱼腥草、党参、何首乌、茜草、川牛膝、甘草、石榴皮、黄芩、茯苓、苦参、枸杞、白术、升麻、大枣、山茱萸和蒲公英均购自绵阳天源堂大药房.根据中药复方的组方原则[6]，选择单味抑菌活性较好的中药辅以补益理气等药物，组成9个复方，如下：

复方1：大黄5+虎杖5/g；

复方2：黄芩2.5+地榆2.5+大黄2.5+虎杖2.5/g；

复方3：黄芩1.7+地榆1.7+大黄1.7+虎杖1.7+茯苓1.6+白术1.6/g；

复方4：黄芩2.5+金银花2.5+蒲公英2.5+紫花地丁2.5/g；

复方5：黄芩1.5+地榆1.5+大黄1.4+虎杖1.4+金银花1.4+蒲公英1.4+紫花地丁1.4/g；

复方6：黄芩1.7+地榆1.7+大黄1.7+虎杖1.7+茯苓1.6+川牛膝1.6/g；

复方7：黄芩1.7+地榆1.7+大黄1.7+虎杖1.7+大青叶1.6+桔梗1.6/g；

复方8：黄芩1.5+地榆1.5+大黄1.4+虎杖1.4+丹参1.4+黄连1.4+黄芪1.4/g；

复方9：黄芩5+地榆5/g.

1.2 主要试剂及培养基

普通营养琼脂和肉汤培养基等(购自北京奥博星生物技术有限责任公司)；微量生化发酵管(购自青岛高科园海博生物技术有限公司)；正丁醇、无水乙醇和丙酮等常规药品为化学纯(购自绵阳市信捷商贸有限责任公司).

1.3 供试菌种

本试验所用大肠杆菌菌株分离自绵阳市某规模化猪场腹泻仔猪病料，由绵阳师范学院动物疫病防控与健康养殖工程技术研究中心鉴定保存.

1.4 中药多糖的提取

将中药用超声波提取3次，浓缩至25 mL，按1∶3的比例加入95%的乙醇，静置过夜，第2天以3 000 r/min离心20 min，除去上清液得到多糖沉淀，加入蒸馏水至恒定体积10 mL；加入Sevage试剂(正丁醇：氯仿=4∶1，Sevage：滤液=1∶5)，以3 000 r/min离心10 min，取上清液，重复两次，以有效去除蛋白质等杂质，至恒定体积为10 mL.具体方法参照参考文献[7].所有药液在立式压力蒸汽灭菌器中121 ℃下灭菌15 min，然后在4 ℃冰箱中保存备用.

1.5 菌悬液的制备

将保存的猪源大肠杆菌在无菌条件下活化后，接种于普通琼脂斜面培养基，37 ℃恒温培养18～24 h，每支斜面加入1.5 mL灭菌蒸馏水，洗净菌液，将细菌浓度调至1.5×106CFU/mL备用.具体方法参考文献[8].

1.6 体外抑菌活性的测定

采用牛津杯法，将灭菌后的液体培养基倒入平板内，待其凝固后，用微量移液器吸取0.1 mL菌悬液，涂布器涂抹均匀，再等距离放入4个牛津杯，用微量加样器吸入含生药1 g/mL的中药多糖溶液0.2 mL于对应牛津杯中，置37 ℃条件下，恒温培养18～24 h，测量抑菌圈直径.

1.7 最小抑菌浓度(MIC)的测定

采用二倍稀释法，每11根试管为一组，重复3次.首先加入2 mL无菌营养肉汤到11支试管中，在1号试管中加入2 mL含1 g/mL的中药多糖溶液吹打混匀，再按照2倍稀释法以此类推，直到第9号试管.此时，试管1～9的混合溶液中药提取物的浓度分别为500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9和0.9 mg/mL，试管10作为阳性对照，试管11作为阴性对照，观察是否有细菌感染.用微吸管将0.1 mL稀释后的菌悬液吸入试管1～9中，37 ℃孵育18～24 h.观察透明和不浑浊的试管，选择浓度最低的试管溶液，即药物对细菌的最低抑制浓度(MIC).

1.8 最低杀菌浓度(MBC)的测定

将上述选出的透明无浑浊试管，吸取溶液0.1 mL加入培养基中，置于37 ℃恒温养24 h.以99.9%杀死试验菌菌体的药物最高稀释度，为最低杀菌浓度(MBC).

2 结果与分析

2.1 单味中药多糖的抑菌活性

实验结果表明，22种中药多糖的初提物对猪源大肠杆菌的抑菌效果存在较大差异，其中黄芩和地榆的体外抑菌活性最强，抑菌圈直径分别为22.3 mm和21.6 mm，MIC和MBC均为7.8 mg/mL，其次是大黄、虎杖、何首乌、黄芪、石榴皮、柴胡、升麻、甘草、山茱萸等中药，其抑菌圈直径均在15 mm以上，也具有较强的抑菌活性.而大枣、党参和大叶茜草三种中药对猪源大肠杆菌没有明显的抑菌效果，见表1.

表1 22味中药对猪源致病性大肠杆菌抑菌结果Tab.1 Antibacterial effect of 22 traditional Chinese medicines on pathogenicEscherichia Colifrom pigs

2.2 复方中药多糖的抑菌活性

9个复方多糖初提物体外抑菌实验结果表明，复方1、复方3、复方6和复方7对猪源性大肠杆菌为极敏感；复方2、复方5、复方8和复方9均出现抗菌能力降低的现象.其中复方3和复方7对猪源大肠杆菌菌的抑菌圈直径分别为27.4 mm、26.5 mm，MIC和MBC均为3.9 mg/mL与单方中抑菌活性最强的黄芩和地榆比抑菌圈明显增大，MIC和MBC均有降低.见表2.

3 结论与讨论

大肠杆菌普遍存在于人和动物的肠道内，危害性大、流行范围广，且发病率和死亡率高，导致畜禽生长缓慢，料肉比低下，给养殖户带来巨大的经济损失.同时血清型多，免疫效果不明显，一直依赖抗菌药物防治，抗生素过量使用导致的药残、耐药性等一系列的危害有目共睹.在中兽医学中中药作为重要组成部位，在临床实践中已运用数10年.本试验选取的22味中药具有活血化瘀、消痈散结、清热解毒和祛湿等功效，且其中大多数中药对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌均有很好的杀菌抑菌效果.其中黄芩、地榆属于清热燥湿解毒类中药对大肠杆菌的MIC和MBC均为7.8 mg/mL；大黄和虎杖次之，MIC为15.6 mg/mL；大枣、党参和大叶茜草没有表现出抑菌效果.刘小凤[9]等研究显示，黄芩对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌作用最强，这与本实验结果相符；罗怡琳[10]等研究显示，大黄等对临床大肠杆菌没有抑菌作用，这与本试验结果不一致；张凯睿[11]等用地榆提取物对大肠杆菌抑菌活性试验显示，地榆正丁醇提取物对大肠杆菌的MIC为3.125 mg/mL，说明地榆对大肠杆菌作用强，此结果与本实验结果一致.本研究发现在中药实际应用中，用量及用法比西药要复杂且量大，临床推广受到很大限制，也会由于提取方法等不同，效果也不同，在众多研究结果中存在一定差异.笔者认为这有可能与中药种类、提取方法、试验条件及大肠杆菌血清型不同等相关；还有可能与中药对机体作用靶点较多，在抑菌的同时还有抗炎、抗氧化和增强免疫力等功效有关.具体的作用机制和用药情况还需进一步深入研究.中药讲究君君臣臣，七情配伍，本试验中，复方3和复方7联合用药时，对猪源性大肠杆菌呈现协同作用，且MIC为3.9 mg/mL，抑菌效果呈相加效果，可以理解为中药中的相须配伍；复方2、复方5、复方8和复方9联合用药时，抑菌效果反倒降低呈无关作用，或可单独用药更好.在戴悦[12]等研究报道得出，复方中药的不同配伍对大肠杆菌呈不同的敏感度，单方的抑菌效果不一定比复方差.所以，在临床用药需根据实际情况，辩证用药.