柑橘CsaccA基因功能鉴定

王 超，杨长耀，李菲菲，马小川，陈岳文，肖志伟，尹 韬，叶 丽，李云松，卢晓鹏

（1湖南农业大学园艺学院，长沙 410128；2中国农业大学园艺学院，北京 100193；3国家柑橘改良中心长沙分中心，长沙 410128；4湖南省园艺研究所，长沙 410128；5湘西州柑桔科学研究所，湖南吉首 416000）

0 引言

乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACCase，EC 6.4.1.2)是一种多亚基复合酶，其在生物体内将乙酰辅酶A羧化进入脂肪酸合成代谢，影响许多其它次生代谢产物产生，是生物体脂肪酸合成的关键调控位点[1]。生物体的ACCase分为主要存在于细菌、双子叶植物以及非禾本科单子叶植物质体中的异质型[2-3]和主要存在于动物、酵母、藻类及高等植物的胞质溶胶中的同质型2种类型。2种形式的乙酰辅酶A羧化酶存在于大多数植物中，当前已从拟南芥、大豆、小麦[4]、玉米[5]、油菜[6]、烟草、麻风树[7]等多种植物中克隆到了异质型ACCase亚基的编码基因。异质型ACCase由生物素羧化酶亚基(BC)、生物素羧基载体蛋白亚基(BCCP)、羧基转移酶α-CT亚基和β-CT亚基组成，这些亚基结合在一起形成ACC全酶，可能以(BC)2(BCCP)4(α-CT，β-CT)2形式存在[8]，但全酶很不稳定，易解离成各种不同的形式。核基因accC、accB、accA分别编码BC亚基、BCCP亚基和α-CT亚基，叶绿体基因accD编码β-CT亚基[9]。

ACCase作为脂肪酸合成的限速酶，在植物种子脂肪酸代谢中发挥重要作用。目前对各种油料作物种子中的乙酰辅酶A羧化酶功能研究比较深入。王宝明等[10]在研究油茶种子发育过程中发现，4个ACCase亚基基因转录量变化的趋势随着种子对脂肪酸需求变化规律具有一致性，表明4个ACCase基因转录与脂肪酸形成关系密切。杨婷等[11]研究胡麻异质型乙酰辅酶A羧化酶4个亚基的生物学功能，结果表明accA、accB、accC和accD4个基因在3个胡麻品种所有时期的不同组织中均有表达，但在种子中的表达量均明显高于其他组织，异质型ACCase基因可能调控胡麻种子发育前期油脂的合成积累。Plank等[12]研究表明，种子早期发育过程中ACC基因表达量的增加与种子成熟时含油量增加呈正相关。Focks等[13]研究表明，拟南芥和油菜种子在发育过程中的BCCP蛋白表达量上调，与ACCase的活性以及种子油脂含量的变化呈正相关。杨青等[14]以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为研究对象，构建了乙酰辅酶A羧化酶BCCP亚基和β-CT亚基重组菌株，并通过诱导表达及响应面优化，进一步提高了脂肪酸的产量。赵爽等[15]研究发现‘绿岭’与‘绿早’2个品种的脂肪含量与ACCase活性呈显著正相关，核仁最终脂肪含量与ACCase活性的相关性较大。王哲等[16]研究了油桐ACCase基因在种子发育的不同时期的表达，在种子的发育过程中4个亚基基因都出现了2个转录高峰，分别为花后145天和花后205天。

作为ACCase 4个亚基之一，accA编码的α-CT亚基在脂肪酸含量调控中也有着重要的作用。Ye等[17]鉴定了一个编码与α-CT亚基相互作用并参与光抑制FAS的羧基转移酶相互作用物(CTI)基因家族，光可以在促进α-CT与CTI之间相互作用的同时减弱脂肪酸合成，说明该亚基在调控脂肪酸合成中有重要的作用。崔燕等[18]克隆棉花accD基因和拟南芥CAC3基因（α-CT亚基）转化到拟南芥和烟草中，结果显示T1代转基因拟南芥叶片脂肪酸含量和拟南芥单株结籽量有所提高，同时认为正向调控accD基因可能会对拟南芥植株的生理形态产生影响。Chen等[19]在绿藻中克隆并过表达了ACCa，发现CW15-24和CW15-85菌株的不饱和脂肪酸含量分别为55.45%和56.15%，与野生型CW15(48.39%)相比显著富集，在莱茵衣藻中ACCa的过表达可以直接增加脂肪酸的合成。目前，异质型乙酰辅酶A羧化酶参与脂肪酸合成以外的功能特点还不十分清楚，accA基因在果实发育中的功能特点研究甚少。

近期，Curtolo等通过‘Murcott tangor’和‘Pera’甜橙杂交群体定位到了一系列品质性状相关的QTL位点，预测其中编码ACCase的α-CT亚基的CsaccA与柑橘果实糖酸品质相关[20]。本研究将甜橙果实的CsaccA基因在番茄中进行异源转化，拟鉴定该基因在调控果实品质和植株生长发育等过程中的功能，以期为下一步调控柑橘树体发育和果实品质形成提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间、地点

试验于2018年9月—2021年9月在国家柑橘改良中心长沙分中心完成。

1.2 试验材料

Micro-Tom番茄种子购自南京丰硕园艺有限公司。试验用工程菌菌株和PBI121载体均为本实验室保存，大红甜橙盆栽于国家柑橘改良中心长沙分中心大棚。

农杆菌悬浮液：大量元素(20×)50 mL/L，微量元素(200×)5 mL/L，铁盐(200×)5 mL/L，有机成分(200×)5mL/L，麦芽提取物0.5g/L，谷氨酰胺1.5g/L，蔗糖40g/L，pH 5.83，121℃15 min高压灭菌，备用。

共培养培养基：大量元素(20×)50 mL/L，微量元素(200×)5 mL/L，铁盐(200×)5 mL/L，肌醇100 mg/L，盐酸硫胺素1.3 mg/L，2,4-D 0.2 mg/L，KH2PO42 mg/L，KT 0.1 mg/L，蔗糖30 g/L，琼脂7.4 g/L，pH 5.83，121℃15 min高压灭菌，备用。

筛选培养基：大量元素(20×)50 mL/L，微量元素(200×)5 mL/L，有机成分(200×)5 mL/L，铁盐(200×)5 mL/L，蔗糖30 g/L，琼脂7.4 g/L，pH 5.83，121℃ 15 min高压灭菌，备用。用时加IAA 0.1 mg/L，ZR 2 mg/L，Kana 100 mg/L，特美汀360 mg/L。

继代培养基：大量元素(20×)50 mL/L，微量元素(200×)5 mL/L，铁盐(200×)5 mL/L，有机成分(200×)5 mL/L，蔗糖30 g/L，琼脂7.4 g/L，pH 5.83，121℃ 15 min高压灭菌，备用。用时加ZR 1 mg/L，Kana 100 mg/L，特美汀360 mg/L。

生根培养基：大量元素(20×)50 mL/L，微量元素(200×)5 mL/L，有机成分(200×)5 mL/L，铁盐(200×)5mL/L，有机成分(200×)5mL/L，IBA2mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7.4 g/L，pH 5.83，121℃15 min高压灭菌，备用。用时加Kana 50 mg/L，特美汀360 mg/L。

1.3 目的基因获得

通过查找甜橙基因组数据库获得该基因序列。使用Primer Premier 5.0软件设计PCR引物(CsaccA-F:ATGGCTACGATTTCACATTCT/CsaccA-R:AGCAAAG CTACGGTTT)，同时引入载体的酶切位点设计基因扩增引物CsaccA-F:acgggggactctagaATGGCTACGATTTC ACATTCT/CsaccA-R:gactgaccacccgggAGCAAAGCTA CGGTTT。从大红甜橙幼嫩叶片提取RNA并反转录为cDNA，引物扩增时PCR程序为：94℃ 1 min，94℃30 s，58℃ 1 min，72℃ 90 s，72℃ 10 min，4℃保存。用1%琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收后低温保存目的基因。

1.4 植物表达载体构建

以重组连接法构建过量表达载体。用Saml和Xbal双酶切PBI121质粒，回收酶切片段，检测浓度。重组连接体系在16℃条件下连接14 h。采用热激法转化到大肠杆菌，挑取单菌落由擎科公司测序。将测序正确的载体命名为PBI121-accA，扩繁后质粒和甘油菌于-80℃冰箱保存。转化农杆菌时，50 μL农杆菌感受态中加入5 μL重组质粒，冰浴25 min，液氮速冻45 s，立即放入37℃水浴5 min，加入0.5 mL LB培养液，28℃、220 r/min震荡培养3 h，取出菌液涂布在含抗生素的LB平板上，在28℃培养箱倒置2天培养。挑取单菌落进行菌落PCR，将阳性菌株用甘油-80℃冰箱保存。

1.5 农杆菌介导番茄遗传转化

番茄种子播种于MS培养基中，6天以后长出2片子叶，真叶未展出，挑取子叶中段剪为长0.4 cm左右，叶背面朝上置于共培养培养基，(25±2)℃暗处预培养24 h。

将农杆菌EHA105在含50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平LB固体培养基上划线培养，用接种环蘸取单菌落涂布新的LB平板，28℃培养24～36 h。无菌手术刀刮取菌体于50 mL MS液体悬浮液中重悬菌体，加入50 mg/LAS，在摇床28℃、220 r/min震荡培养30 min～1 h，测得OD600值为0.3～0.6，用于子叶侵染。

1.5.1 侵染 将暗培24 h后的子叶放入无菌锥形瓶中，倒入悬浮的菌液，轻微摇晃5 min。侵染结束后用无菌滤纸吸干子叶表面残留菌液。

1.5.2 预培养 将侵染后的子叶接种于新的共培养培养基，(25±2)℃黑暗预培养48 h。

1.5.3 筛选培养 将预培养2天后的子叶正面朝上接种在筛选培养基上，培养基充分接触子叶切口，25℃光照培养。培养7天左右，番茄叶片边缘长出白色愈伤组织，12天后转入继代培养基。10～14天愈伤组织分化出芽点，约1个月后将疑似阳性苗转入生根培养基，生根后根据需要移到培养土中培养。

1.6 转基因番茄阳性鉴定

利用CTAB法提取转基因和野生番茄的DNA，以转基因植株番茄DNA为模板，未转化植株的番茄DNA为对照，用35S做上游引物，扩增目的基因的下游引物进行PCR扩增，同时用卡那霉素基因的上下游引物进行PCR扩增，所需引物序列为Kan-F(GAGCGGCGATACCGTAAA)、Kan-R(GGTGCCCTG AATGAACTGC)、35S-F(GACGCACAATCCCACTA TCC)，用1%琼脂糖凝胶电泳检测。本载体含有GUS标记基因，取转基因和野生型番茄果实使用GUS进行染色，37℃过夜处理，70%酒精进行脱色处理，叶片或果实出现稳定蓝色斑点的为阳性植株。

1.7 高效液相色谱法(HPLC)测定番茄果实中有机酸和糖含量

取野生型和转基因番茄株系果实进行品质分析，野生株系6个生物学重复，转基因株系8个生物学重复。每个样的果实留取种子后用液氮研磨，称取3 g果肉，加入4 mL超纯水，70℃水浴30 min，室温放置10 min，再水浴0.5 h，然后室温放置冷却之后放到-40℃预冷0.5 h，然后放到冻干机浓缩24 h，压缩成干粉，然后取样加2 mL水稀释。采用HPLC方法检测样品中的糖酸组分含量，具体分析方法参考Lu等[21]的方法进行。

1.8 转基因植株生物学性状统计

选取相同培养条件下的野生型和转基因植株，用游标卡尺测量野生番茄植株和转基因植株的株高、主茎粗度、冠幅等，测量每个指标时相对方向测量2次取平均值，各指标每周进行1次测量。果实采收结束后，将整个植株取出清洗和分离根、茎、叶组织，放置60℃烘干至恒重，测量转基因植株和野生植株的叶片、茎和根干重。各项统计均设3次生物学重复。

1.9 数据处理和分析

采用Excel 2003软件进行数据整理和作图，采用SPSS 26.0软件进行显著性差异比较，用Photoshop进行图片处理。

2 结果与分析

2.1 转CsaccA基因番茄植株及转基因表型

通过农杆菌介导番茄进行遗传转化，连续进行2代鉴定，筛选培养后获得了纯合转基因株系。PCR鉴定结果显示，转基因植株（泳道1～4）和野生植株（泳道5）都扩增出了目的基因(2322 bp)；转基因植株扩增出卡那抗性基因（约500 bp），而野生型植株未扩增出卡那抗性基因。以构建的PBI121-accA载体（泳道6和12）做阳性对照，转基因植株扩增条带均与阳性对照一致（图1A）。对果实进行GUS染色结果表明，CsaccA基因在果实中高量表达，不同植株果实均可检测到GUS信号（图1B）。

图1 转基因植株阳性鉴定

转基因植株的生物量与野生型植株存在显著性差异。转基因植株的长势明显优于野生型植株，其植株整体和各组织部位均表现出巨大性（图2）。植株各组织部位的生物量统计表明，转基因植株根系鲜重是野生型的约10倍，干重是野生型的约4倍；转基因植株茎鲜重约是野生型的5倍，干重约是野生型的7倍；转基因植株叶鲜重约是野生型的3倍，干重约是野生型的4倍（表1）。

图2 野生型与转基因植株比较

表1 转基因与野生番茄不同组织干重和鲜重 g

2.2 转CsaccA基因番茄植株发育特征

转基因植株的生长发育过程明显优于野生型。转基因和野生型植株均于播种后4天发芽，转基因植株播种后28天开花，野生型35天开花。转基因植株播种后42天开始座果，播种后第73天开始转色，播种后第77天开始成熟；而野生植株播种后56天开始坐果，播种后84天开始转色，播种后91天开始成熟。转基因植株的生长发育物候期及果实成熟期提前（图3A）。

转基因番茄植株观察显示，转基因植株在播种后14天内与野生型无显著差异，之后普遍强于野生型。转基因植株茎粗在番茄播种21天后到果实成熟整个生长发育过程中显著大于野生型（图3B），转基因植株株高在播种35天始显著高于野生型植株（图3C），转基因植株的冠幅在播种后21～70天显著大于野生型植株，之后两者相似（图3D）。

图3 转基因和野生型番茄发育过程

2.3 转CsaccA基因番茄果实糖酸含量分析

番茄果实中主要的糖是果糖和葡萄糖，柠檬酸是主要的有机酸。转CsaccA基因番茄果实中果糖和葡萄糖含量显著高于野生型，而蔗糖含量显著低于野生型。转CsaccA基因番茄果实柠檬酸含量显著低于野生型（图4）。

图4 转基因与野生番茄果实糖酸含量分析

3 结论

笔者以Micro-Tom番茄异源转化研究了柑橘CsaccA基因的功能，结果表明该基因可显著加快转基因植株的生物量和生长速度，同时可以显著增加果实的糖酸比。因此，柑橘CsaccA基因参与脂肪酸合成和乙酰辅酶A的消耗，在调控柑橘果实品质方面有重要作用。在本研究的基础上，下一步需深入研究其调控果实品质的机理。

4 讨论

ACCase是脂肪酸合成的关键和限速步骤，反应过程催化消耗掉乙酰辅酶A，而乙酰辅酶A是联系糖、脂和蛋白质氨基酸等各种生物分子相互转化的桥梁物质和调节物质。ACCase调控脂肪酸含量的同时，乙酰辅酶A的消耗对于需要其参与代谢的过程也产生较大影响。

王伏林等[22]将大肠杆菌ACC各亚基的编码基因在油菜中过表达，研究表明串联表达载体转化油菜获得的阳性转化株系比对照植株含油量平均提高了5.7%。Klaus等[23]在马铃薯块茎的淀粉体中过量表达拟南芥的ACCase，导致脂肪酸合成增加，三酰甘油含量增加5倍以上。Davis等[24]将编码大肠杆菌ACCase 4个亚基的基因克隆到单个质粒中，在噬菌体T7启动子控制下，诱导基因表达后过量生产的蛋白质导致大大增加了其活性，同时增加了细胞内的丙二酰辅酶A水平，脂肪酸合成增加了6倍。Yukiko等[25]通过烟草超量表达accD提高了质体ACCase水平，叶片的脂肪酸含量提高，同时发现转化个体的叶片寿命明显延长，结籽量提高2倍。上述研究均说明乙酰辅酶A羧化酶在脂肪酸合成中的重要作用，而乙酰辅酶A羧化酶和乙酰辅酶A参与众多代谢过程，该步骤的改变影响植物脂肪酸外的哪些性状尚不十分清楚，对果实品质形成有何影响不得而知。本研究从甜橙中克隆获得一个编码ACCase的α-CT亚基的CsaccA基因，该基因在番茄中超量表达后植株生长量显著增加，表明ACCase功能增强与植株发育密切相关；转基因果实主要糖含量显著升高而柠檬酸含量显著降低，表明ACCase功能增强消耗了更多的乙酰辅酶A，消耗削弱了TCA循环柠檬酸的合成，使果实积累糖类等更多的上游初生代谢物。

综上，ACCase参与了乙酰辅酶A的消耗过程，乙酰辅酶A的消耗削弱了果实酸代谢的能力，同时也增强了上游糖的积累，从而起到了调控果实品质的作用。编码ACCase的α-CT亚基CsaccA基因在此过程中起到了促进糖积累和降低酸积累的作用，为下一步调控柑橘树体发育和果实糖酸品质形成奠定了基础。本研究是为数不多的关于ACCase参与果实品质形成调控的报道，对研究果实糖酸代谢提供了新的思考；同时，由于柑橘类作物转基因的限制，本研究采用异源转化番茄的方法分析了基因的功能，CsaccA基因在柑橘树体发育、脂肪酸代谢、果实初生代谢和次生代谢物积累中的具体功能还需要深入研究。