秸秆降解菌系的筛选及其对酸碱度的响应

张 云，萨如拉，包桂荣，萨茹拉其其格，邰继承，李 响

（1内蒙古民族大学农学院，内蒙古通辽 028000；2鄂尔多斯市林业和草原综合执法支队，内蒙古鄂尔多斯 017000）

0 引言

中国北方低温持续时间较长，玉米秸秆还田后秸秆腐解速率较慢，腐解效果较差，影响北方地区大量玉米秸秆还田的可施行性。提高秸秆还田效率，选育优良微生物菌剂是微生物处理的关键。降解秸秆微生物多为常温(20～28℃)[1-5]和高温(30～55℃)[6-12]菌，近几年选育的低温秸秆降解菌多样化，降解效果有差异。赵伟等[13]认为东北黑土区低温菌剂施入玉米秸秆还田较常温菌剂显著提高土壤微生物数量、土壤酶活性及微生物碳、氮含量。张恒芳[14]发现，黄杆菌属(Flavobacterium)和溶杆菌属(Lysobacter)混合菌剂处理在12℃对秸秆各组分降解效果最好。刘爽[15]在15℃条件下筛选草酸青霉Penicillium oxalicumQSH3-3、尖孢镰刀霉Fusarium oxysporumDSH2-3、毛壳霉Chaetomiumsp.YSH3-3以及DSH2-3与YSH3-3的组合菌，在10～25℃范围内，秸秆还田模拟试验中菌株DSH2-3对小麦秸秆的降解效果较好，组合菌对水稻和玉米秸秆的降解效果较好。杜俊杰[16]选育降解玉米秸秆低温兼性厌氧纤维素降解菌系，在低温条件下绝大部分有机物可被耐低温微生物降解。低温玉米秸秆降解优良菌株报道较少，笔者筛选低温条件下降解玉米秸秆的菌系并研究其培养条件，以期为加速内蒙古地区秸秆腐熟还田提供菌株资源。

1 材料与方法

1.1 试验时间、地点

试验于2020年9月在内蒙古民族大学微生物实验室进行。

1.2 试验材料

玉米‘农华101’收获期秸秆；腐烂物（腐烂树叶、锯末、腐烂纸盒、朽木、烂草、玉米秸秆、水稻秆、竹叶、羊粪和牛粪），草甸土，沼泽地污泥，蚂蚁洞边土，多年堆放秸秆堆土；腐烂树叶、腐烂纸盒、朽木、蚂蚁洞边土采自包头市土默特右旗萨拉齐镇，锯末、沼泽地污泥、烂草和牛粪采自西藏拉萨市，羊粪和草甸土采自西藏那曲班戈县，玉米秸秆、水稻秆和竹叶采自四川遂宁市，多年堆放秸秆堆土采自通辽市扎鲁特旗；中农绿康秸秆腐熟剂从中农绿康生物技术有限公司购买。奥梅梁斯基培养基[15]、玉米秸秆培养基[15]、液体产酶培养基[15]均于121℃、0.1 MPa条件下灭菌30 min备用。

1.3 试验方法

采集年平均气温-0.6～8℃的高寒地区富含纤维素分解菌的腐烂物分别与450 g草甸土、树林土、蚂蚁洞边土、多年堆放秸秆堆土混匀，采用滤纸崩解法、天然玉米秸秆粉培养法富集培养纤维素分解菌，并选滤纸变黄、变断裂溃烂、玉米秸秆粉蓬松变为棉絮状的培养物继代培养，筛选秸秆降解菌系；以筛选到的秸秆降解菌系和生产中主推的秸秆腐熟剂为试材，进行玉米秸秆发酵试验，温度设15、20℃ 2个梯度，pH 4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5 6个梯度，每个处理设3个重复。

以基础培养基为继代培养基，秸秆降解菌系8号15℃条件下连续继代培养15代后，以秸秆腐熟剂为对照，在不同温度、pH条件下接种到产酶培养基中振荡培养，每隔24 h取发酵液，使用紫外分光光度计测定OD600值，绘制生长曲线；采用3,5-二硝基水杨酸法[8]测定发酵15天的发酵液滤纸酶和纤维素酶活性。将秸秆降解菌系和秸秆腐熟剂分别接种到玉米秸秆为唯一碳源的玉米秸秆培养基中15、20℃培养15天后测定玉米秸秆降解率[式(1)]，5次重复。

式中，W0表示接种前培养基中的秸秆干重，W1表示发酵结束后秸秆干重。

1.4 数据分析

数据通过DPS 15.10和Excel软件进行统计与分析。

2 结果与分析

2.1 秸秆降解菌系8号的筛选

由图1可知，富集培养物纤维素分解能力较强，滤纸出现了很明显的溃烂，气液界面滤纸出现孔洞、变薄，7天后滤纸就断裂，20～30天把滤纸分解成絮状。蚂蚁洞边土与腐烂物混合样品、多年堆放秸秆堆土与腐烂物混合样品对滤纸的降解效果差，15天内滤纸几乎没有变化，这20个样品被淘汰。

图1 纤维素分解菌的富集及初筛试验部分图片

秸秆降解菌系继代培养中，20℃培养条件下随着传代次数的增加对滤纸、玉米秸秆的分解速度逐渐加快，第5～6代复合菌系分解纤维素的速度明显加快，第6代菌系在接种的第3天贴于瓶壁上的滤纸液面以上部分变得粗糙膨松，培养液由透明逐渐呈现黄褐色、绿色或黑色；到第5～6天，培养液面上部的滤纸全部变黄，培养液面下部贴近液面的滤纸变得松软多孔；第7天气液界面处滤纸断裂。秸秆降解菌系分解滤纸所需时间超过15天的13个样品被淘汰；其余7个菌系在以玉米秸秆为唯一碳源的液体、固体培养基上驯化。在玉米粉培养基上长有同心圆状、土灰色菌株和白粘的小点点菌落。秸秆降解菌系8号对玉米苞叶和茎髓降解较好，30天玉米苞叶厚壁组织和叶肉被降解，摇试管时断裂（图2）。

图2 复合菌系对滤纸和玉米秸秆降解效果

2.2 温度和pH对秸秆降解菌系生长的影响

从图3可知，15℃玉米秸秆发酵10天内，pH 4.5、pH 6.5和pH 9.5秸秆降解菌系8号OD600值先下降，发酵第3天缓慢上升；pH 5.5时发酵前3天OD600值逐渐增加，到第4天有所降低；pH 7.5时第1～2天OD600值上升，第3天有所下降后缓慢上升；pH 8.5时培养前6天OD600值逐渐增加；秸秆降解菌系8号pH 4.5～9.5发酵5～6天OD600值直线上升，到第6天达到峰值，最大峰值是pH 7.5发酵液OD600值0.965，之后逐渐下降。

图3 秸秆降解菌系8号15℃条件下生长曲线

从图4可知，20℃玉米秸秆发酵10天内，秸秆降解菌系8号pH 4.5～9.5发酵液培养前期OD600值总体逐渐上升，OD600值第7天达到峰值，最大峰值是pH 8.5发酵液OD600值1.177，之后逐渐下降。pH 4.5和pH 8.5发酵第6天OD600值有所下降，pH 6.5发酵第4天OD600值有所下降，pH 7.5和pH 9.5下发酵第3天OD600值有所下降。

图4 秸秆降解菌系8号20℃条件下生长曲线

从图5可知，15℃玉米秸秆发酵10天内，秸秆腐熟剂OD600值发酵1～6天呈现“W”字样变化，发酵4～6天发酵液OD600值直线上升，第6天达到峰值，最高峰值为pH 7.5发酵液OD600值1.109，随后急速下降。

图5 秸秆腐熟剂15℃条件下生长曲线

从图6可知，20℃玉米秸秆发酵10天内，秸秆腐熟剂pH 4.5和pH 9.5发酵第5天OD600值缓慢下降，第6天开始逐渐上升；pH 5.5、pH 6.5、pH 7.5、pH 8.5发酵液OD600值1～6天呈上升趋势。秸秆腐熟剂发酵液OD600值大体呈先增后减的趋势，发酵第7天达到峰值，最高峰值为pH 5.5发酵液OD600值1.012，随后急速下降。

图6 秸秆腐熟剂20℃条件下生长曲线

2.3 温度和pH对秸秆降解菌系纤维素酶活性的影响

从表1可知，15℃和20℃条件下，随着pH的增加，秸秆降解菌系8号和秸秆腐熟剂发酵液滤纸酶活性均呈先增加再降低的趋势。15℃条件下，秸秆降解菌系8号不同pH发酵液滤纸酶活性无显著差异；秸秆腐熟剂pH 4.5～7.5发酵液滤纸酶活性间无显著差异，pH 8.5发酵液活性与pH 4.5、pH 6.5、pH 7.5的活性无显著差异；pH 9.5发酵液活性显著低于其他处理。20℃条件下，秸秆降解菌系8号pH 5.5～9.5发酵液滤纸酶活性无显著差异，其中pH 5.5～8.5发酵液滤纸酶活性显著大于pH 4.5；秸秆腐熟剂不同pH发酵液滤纸酶活性无显著差异。

表1 玉米秸秆发酵体系滤纸酶活性 U/mL

15℃、pH 8.5培养条件下，秸秆降解菌系8号滤纸酶活性显著高于秸秆腐熟剂发酵液；相同温度下其余处理间无显著差异。

从表2可知，随着发酵液pH的增加，15℃秆降解菌系8号发酵液纤维素酶活性先增加后降低，秸秆腐熟剂发酵液纤维素酶活性逐渐下降的趋势。15℃条件下，秆降解菌系8号pH 5.5、pH 6.5和pH 7.5发酵液纤维素酶活性无显著差异，其中pH 7.5活性显著高于pH 4.5、pH 8.5和 pH 9.5的活性；pH 4.5、pH 5.5、pH 6.5、pH 8.5和pH 9.5间纤维素酶活性无差异；秸秆腐熟剂pH 4.5、pH 5.5、pH 6.5、pH 7.5、pH 8.5间无显著差异，pH 6.5、pH 7.5、pH 8.5、pH 9.5发酵液纤维素酶活性间无显著差异，pH 4.5和pH 5.5发酵液活性显著高于pH 9.5。20℃条件下，秸秆降解菌系8号和秸秆腐熟剂不同pH发酵液纤维素酶活性均无显著差异。

表2 玉米秸秆发酵体系纤维素酶活性 U/mL

相同培养条件下，pH 5.5、pH 6.5、pH 8.5、pH 9.5秸秆降解菌系8号和秸秆腐熟剂发酵液纤维素酶活性间无显著差异；20℃、pH 4.5条件下，秸秆腐熟剂发酵液纤维素酶活性显著高于秸秆降解菌系8号；15℃、pH 7.5条件下，秸秆降解菌系8号纤维素酶活性显著高于秸秆腐熟剂发酵液。

2.4 温度和pH对秸秆降解菌系秸秆降解率的影响

从图7可知，15℃条件下，秸秆降解菌系8号pH 6.5和pH 7.5秸秆降解率显著高于其余pH的降解率，pH 4.5降解率最低；而秸秆腐熟剂pH 4.5和pH 5.5的显著高于其余pH的降解率。20℃条件下，秸秆降解菌系8号pH 7.5秸秆降解率显著高于其余发酵液的降解率，pH 6.5、pH 8.5和pH 9.5的降解率无差异，但它们显著高于pH 4.5和pH 5.5的降解率；而秸秆腐熟剂pH 4.5和pH 5.5的显著高于其余pH下的降解率。

图7 玉米秸秆发酵体系秸秆降解率

相同pH下，20℃的秸秆降解菌系8号pH 4.5的降解率显著低于15℃的，其余pH 2个温度下的秸秆降解率无差异；秸秆腐熟剂pH 9.5 2个温度秸秆降解率无差异，其余pH 20℃的降解率显著大于15℃的。相同温度下，pH 4.5 2种菌系秸秆降解率间无差异，其余pH下秸秆降解菌系8号秸秆降解率显著大于秸秆腐熟剂的降解率。

3 结论与讨论

采用的3种富集培养方法中，玉米秸秆粉震荡培养法富集到的纤维素分解菌材料较少，可能是玉米秸秆粉的成分比滤纸复杂，纤维素浓度较高，选择压力太大且富集培养代数不够，难以在短期内明显降解玉米秸秆粉，所以筛选玉米秸秆分解菌时采用玉米秸秆培养基上多代驯化培养是非常必要的。玉米秸秆降解的过程中，木质素的坚韧结构是降解过程的最大阻碍[17]，产各种纤维素酶系的菌吸附到玉米秸秆表面，导致微纤维链间氢键结合减弱、吸水力增加、纤维溶胀[18]、水解底物，需要各类菌株所产生的酶类协同才能完成对玉米秸秆的降解。玉米秸秆复合菌系对玉米茎髓部分的降解较多，玉米茎髓部位是秸秆中可利用纤维含量最高的部位[19]。玉米茎髓纤维素含量为玉米茎髓质量的45%，半纤维素为35%，木质素为15%；玉米秸秆中纤维素含量43%，半纤维素27%，木质素20%[20]。茎皮的木质素含量是茎髓的1.3倍，在全株中的比例为20.5%；茎髓占玉米秸秆的18.57%；酸性洗涤纤维和木质素含量均以茎皮中最高（分别为52.0%和14.4%），苞叶中最低（分别为38.2%和6.7%）[20]。据此，本研究驯化玉米秸秆降解菌时，碳源的选用顺序是滤纸条、玉米苞叶、茎髓、茎皮，逐渐增加木质纤维含量。降解后的秸秆，茎髓降解较多，而外表皮被降解得较少。这可能与玉米秸秆外表皮结构有关。外表皮是由致密的表皮细胞构成，且表皮木质化严重，微生物分泌的酶很难与秸秆中的纤维素及半纤维素分子接触，造成了降解困难，而玉米秸秆的茎髓是含有大量纤维素及半纤维素的微管束，同时茎髓的薄壁细胞结构疏松，具有吸水能力，对降解有利。

pH能够影响秸秆的腐殖化进程，溶液酸碱度影响秸秆腐殖化产物[21]。秸秆发酵产物包括十五烷酸、正十六烷酸、2,4-二叔丁基酚和6-叔丁基对甲酚等酸、酚类物质会抑制菌株B(Bacillus cereus)降解水稻秸秆的效率，菌株D2(Bacillusamyloliquefaciens)、W1(Ochrobactrum intermedium)、G1(Bacillus licheniformis)组成的复合菌群能够减少包括4种物质在内的酸、酚类含量，来提高秸秆降解效率[22]。学者们选育的秸秆降解菌系对pH有不同的响应，复合菌系GF-20可在较大的温度(4～30℃)和pH(6.0～9.0)范围内保持较高的纤维素和半纤维素酶活性，能发挥秸秆降解作用[23]；复合菌系LDC降解玉米秸秆的最佳降解条件为培养温度32℃、初始pH 8.2[24]；pH 8.2、含水量1.42%、保藏湿度10%、保藏温度15℃时，玉米秸秆降解复合菌系GFS72降解玉米秸秆的效率最高[25]；复合微生物CM17菌系在35、45、55℃，pH 6、pH 7.5、pH 10，都能正常分解纤维素[26]；草酸青霉(Penicillium oxalicum)菌株QSH3-3土壤偏碱性条件下对秸秆纤维素类物质的降解具有较高的应用潜力[27]；木质素的降解率与pH呈负相关，纤维素的降解率与pH呈正相关[28]；pH变化规律能够反映WSC-6对木质纤维素的分解进程及分解活性[29]；pH 4.0时漆酶对玉米秸秆木质素发生脱甲基作用最强[30]。本研究中秸秆降解菌系8号发酵适宜pH 7.5，15℃和20℃下无显著差异；秸秆腐熟剂发酵适宜pH 5.5，适宜温度为20℃。相同发酵条件下，秆降解菌系8号秸秆降解率显著高于秸秆腐熟剂降解率。农田条件下，秸秆腐解主要发生在秸秆还田后的前3年，累积腐解量达77.0%，腐解率随时间呈线性下降[31]；土壤温度的增加显著促进了稻秆的好氧分解[32]，稻秆的分解速率随着温度(-5、5、10、15、25℃)的升高而增加[33]；随着温度的降低，土壤有机物分解的温度敏感性增加[34]，低质量土壤中具有更高的温度敏感性[35]；温度、秸秆质量和微生物碳源引起的微生物PLFA组成的变化可能会导致秸秆分解的变化[36]；在15、25、35℃的潮土条件下，秸秆化学性质差异占小麦秸秆腐解细菌群落组成变异的19.3%、土壤性质差异占24.0%、温度差异占7.4%，秸秆的化学性质对小麦秸秆腐解过程中不同温度下细菌群落的组成产生了显著的影响[37]。大量来自更难降解的碳库，如纤维素和木质素的降解率取决于温度[38]；若尔盖高原湿地沼泽土中分离到15～20、25～30、40～50℃3个温度型的纤维素分解菌，不同纤维素分解菌的降解能力相差较大[39]；玉米秸秆腐解微生物代谢多样性在不同温度(15、25、35℃)下差异显著[40]。-3℃和18℃下的玉米秸秆和甘蓝废弃物共青贮系统具有更高的生物降解潜力，并伴有较低的酸性洗涤剂木质素(ADL)含量；而在34℃下生物降解潜力低、ADL含量高[41]。后续试验将在变温、酸性土壤、中性土壤、碱性土壤等不同条件下，探索秸秆降解菌系对不同作物秸秆的降解过程中微生物群落组成的变化及其降解效果。