PCSK9与高脂血症性胰腺炎相关性机制探讨

杨小妹,马康康,高俊茶

【提要】 高脂血症性胰腺炎在近十年中越来越受到人们的关注，与其他病因胰腺炎相比，高脂血症性胰腺炎重症化比例高，并发症更多，预后更差，具有复杂的病理生理过程。虽然最新的很多研究揭示了高脂血症性胰腺炎的发病机制，但是对于高脂血症性胰腺炎的分子机制仍然知之甚少，因此，迫切需要对该病的病理生理机制进行进一步研究。前蛋白转化酶枯草杆菌素/kexin9型是前蛋白转化酶家族中的一种，由血管内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞分泌，主要通过调节肝脏低密度脂蛋白受体的表达和分泌活性来发挥作用，具有调节脂质代谢、参与炎症反应、介导细胞凋亡等作用。有研究发现，前蛋白转化酶枯草杆菌素/kexin9型可作为胰腺炎新的诊断分子，参与疾病的发生发展过程，对整体预后的预测有一定的作用。遗憾的是，目前，相关报道尚不多，具体分子作用机制尚不明确，因此，本文将前蛋白转化酶枯草杆菌素/kexin9型与高脂血症性胰腺炎的关系做一综述。

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是一种典型的无菌性内源性胰腺损伤形式，表现为局部或胰腺周围炎症，甚至为全身性炎症反应综合征和远处多脏器损伤。尽管当前临床上AP的诊治水平有所提高，但该病的死亡率仍保持在5%左右[1]。已知在所有病因中，高脂血症性急性胰腺炎(hypertriglyceridemia acute pancreatitis，HLAP)的症状和并发症更为严重，且易反复发作[2]，此外，HLAP病理分级也更为严重，更容易迅速进展为坏死性胰腺炎，导致重症胰腺炎[3]。已有大量研究证实，炎症介质及细胞因子激活并发级联反应导致全身炎症反应在HLAP的发病机制中发挥重要地位[4]，在急性反应期持续的全身炎症反应更容易发展为重症化。因此，只有充分了解HLAP的病理生理机制，才能识别潜在的重症急性胰腺炎患者，并使其尽快得到重症监护和恰当治疗[5]。

目前游离脂肪酸及炎症反应已成为当前研究的热点。游离脂肪酸可通过激发炎症反应的恶性循环、进而导致细胞膜受体活性改变及细胞器破坏，造成胰腺腺泡细胞损伤进而引发HLAP。其中由核转录因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)引发的炎症变化是造成AP病情加重的原因之一。已知在前蛋白转化酶枯草杆菌素/kexin9型(proprotein convertase subtilisin/kexin type9，PCSK9)介导的炎症研究中，Toll样受体4(toll-likereceptor-4，TLR4)/NF-κB通路是影响炎症的主要信号通路，可以激活NF-κB上调炎性细胞因子的表达，引起炎症反应[6]。也有研究发现，携带PCSK9功能减弱基因的患者血浆促炎症因子IL-6、IL-8及TNF-α水平显著低于携带PCSK9功能增强基因的患者[7]，与全身和血管炎症之间存在密切关系[8]。有研究报道，在AP发病过程中，由于内毒素血症，导致脂多糖升高，刺激肝细胞合成和分泌PCSK9 增加[9]，进一步导致全身炎症反应的持续，引起局部并发症的发生，最终表现为预后不良，临床病程反复[10]。并且有研究提出PCSK9与甘油三酯水平存在正相关关系[11]，而甘油三酯水平升高与HLAP密切相关，这些发现提示PCSK9可能在HLAP炎症反应中发挥重要作用。因此，明确PCSK9在HLAP的中病理生理机制势在必行。

1 PCSK9结构

PCSK9是一个74 kDa的酶原，由12个外显子组成，全长22 kb，编码692个氨基酸。由4个结构域组成，即N端前结构域、信号肽、催化结构域和C端结构域。在后者中，又包含M1、M2和M3三个模块。含组氨酸最丰富的模块是M2，包含14个跨结构域组氨酸中的9个(CHRD)，PCSK9由分子量为74 kDa的可溶性原PCSK9在内质网或高尔基体中通过自催化作用，并从N端释放分子量为14 kDa的原肽，随后生成成熟蛋白(60 kDa)。这种自切割对PCSK9的生物学反应和成熟度至关重要。在自催化之后，会暂时结合到催化结构域的活性位点上，护送活性的PCSK9贯穿整个细胞，这是该酶所独有的。前结构域N端抑制PCSK9的转化酶活性，阻止其与周围底物相互作用。提示前结构域通过释放催化结构域来调节PCSK9的作用[12]。研究发现，PCSK9在肝脏、小肠和肾脏中广泛表达，肝脏是PCSK9蛋白发挥作用的主要靶点，也是PCSK9循环的主要来源[13]。据国外研究报道，PCSK9 mRNA还表达在小鼠胰岛上，不过PCSK9 mRNA是否在人体胰岛上表达尚无报道[14]。

2 PCSK9功能

PCSK9是原蛋白转换酶家族中的第九个成员，于2003年，Abifadel和他的同事在两个家族性高胆固醇血症常染色体显性遗传的法国家庭中发现了编码PCSK9的基因突变，并被确定为胆固醇稳态的参与者[15]。在大脑神经元凋亡的情况下，PCSK9 cDNA有一定程度的上调，因此，经鉴定，它最初被命名为神经凋亡调节转换酶1(neural apoptosis-regulated convertase 1，NARC-1)[13]，是参与原蛋白激活的分泌蛋白家族的新成员[16]。

PCSK9主要生理功能是调节肝脏中低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor，LDLR)半衰期的循环蛋白。PCSK9在肝脏作为前体蛋白产生后，经过分子内自催化裂解，由此产生的异源二聚体被分泌进入循环。PCSK9与LDLR的表皮生长因子前体同源结构域A结合，并与受体一起内化。在酸性条件下，存在于核内体中的LDLR和PCSK9之间的亲和力增加，导致LDLR的构象改变，阻止了LDLR的正常循环，促使LDLR转运到溶酶体进行降解，使血浆中LDL水平增高，在胆固醇稳态中发挥调节作用[17]。LDLR-PCSK9复合物发生细胞内转运的机制尚未完全阐明。该复合物可以通过细胞外核内体-溶酶体途径或通过细胞内高尔基-溶酶体途径到达溶酶体。随着对PCSK9研究的不断深入，发现除可调控LDLR水平之外，还具有参与炎症反应、介导细胞凋亡等生物功能。下面就PCSK9与HLAP相关的炎症反应、脂代谢、细胞凋亡等方面做一阐述。

3 PCSK9致HLAP可能的机制

3.1 PCSK9 与炎症反应

目前已经有很多关于PCSK9对促炎细胞因子影响的研究，有动物实验结果表明，感染和炎症刺激PCSK9的表达。PCSK9基因敲除小鼠表现出炎性细胞因子的产生减少，对脂多糖的反应降低，对机体具有保护作用，而PCSK9过表达则会加剧多器官病理损伤以及脓毒症早期的促炎状态。在转基因小鼠的体外实验中也发现，升高 PCSK9 浓度可以诱导巨噬细胞LDLR相关蛋白1的降解，而LDLR相关蛋白1缺乏则下调了巨噬细胞中抗炎表型M2表达，同时刺激巨噬细胞表达促炎表型M1，并加强炎症因子的分泌[18]。

值得注意的是，NF-κB在PCSK9表达介导的炎症刺激中具有重要的信号传导作用。巨噬细胞中PCSK9过表达可诱导NF-κB核移位，增加促炎细胞因子mRNA水平和TLR4表达，促进促炎基因的表达，从而导致全身炎症[12]。相比之下，在oxLDL处理后的巨噬细胞，PCSK9基因敲除显著减弱了这些影响，有研究表明，由于PCSK9 C末端富含半胱氨酸结构域与抵抗素结构同源，推测PCSK9可能通过与TLR4的C末端结构域结合，上调TLR4的表达，激活TLR4/NF-κB信号通路，从而上调促炎细胞因子水平[15]。然而，还需要更多的研究来阐明PCSK9激活TLR4/NF-κB通路的机制。还有研究表明，PCSK9与氧化低密度脂蛋白受体-1(oxidized LDL receptor-1，LOX-1)以相互促进的方式相互作用，增加对oxLDLs的摄取，oxLDLs作为配体结合TLR4，激活NF-κB从而上调炎性细胞因子的表达，诱导促炎状态[19]。这些观察表明PCSK9调控TLR4的表达和NF-κB的激活以及与LOX-1以相互促进的方式相互作用，促进炎症的表达。

近年来，大量的研究数据证实了NF-κB的激活和氧化应激在AP发生、发展过程具有损伤和促进作用[20]。尽管NF-κB在腺泡内激活的机制尚不清楚，但有研究表明，病理钙信号、蛋白C亚型激活和活性氧产物的生成启动了腺泡内NF-κB炎症级联反应，并且抑制该活性可减轻AP的严重程度[21]，因此，认为NF-κB活化是炎症进展的关键步骤。1998年，Gukovsky等首次报道了AP期间腺泡细胞NF-κB的活化。并表明病理性胰蛋白酶原激活的缺失并不影响腺泡内NF-κB的激活，NF-κB激活是一个独立于胰蛋白酶原激活的早期事件，并在诱发AP中充分发挥作用[22]。然而，目前还不清楚发展为AP是否同时需要这两个条件。正常生理条件下TLR4/ NF-κB通路的活化可激活机体免疫应答，然而炎症级联反应是在天然免疫反应开始之前通过NF-κB的激活在腺泡细胞中开始的，并且通过TLR促发的髓样分化因子88途径启动有关基因的转录[23]，同时释放的炎症因子又可以作为激活物激活NF-κB，放大炎症反应，导致病情进一步加重。此外，也研究证实，柴苗皂苷a通过与NF-κB密切相互作用，抑制其信号通路，随后抑制AP相关促炎细胞因子的释放，对炎症反应起到保护作用，减轻器官损伤[1]。可以看出，在AP的发病机制中，NF-κB在将初始腺泡损伤与全身炎症联系起来中起着核心作用。因此，PCSK9在NF-κB信号通路中可能作为一个新的靶点参与调节AP的炎症反应过程。

3.2 PCSK9与细胞凋亡

细胞凋亡是一种不引起炎症反应的程序性细胞死亡，细胞凋亡的复杂性一直是众多研究的焦点，已知p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 motigen-activated protein kinase， MAPK)通路是真核生物信号网络中最重要的信号通路之一，参与多种细胞功能，特别是细胞增殖、分化和凋亡。有动物实验表明，在载脂蛋白E基因敲除的小鼠中，PCSK9可通过c-Jun氨基末端激酶/MAPK信号途径诱导内皮细胞凋亡[24]。Ece等[23]揭示了oxLDL刺激引起的血管内皮细胞凋亡增加与PCSK9过表达之间的相关性。应用RNA干扰技术抑制PCSK9表达可影响Bcl-2/Bax比值的变化，降低半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinecontaining aspartate-specific proteases9和3，Caspase9和3 ) 的活性，明显抑制oxLDL诱导的巨噬细胞凋亡。有研究结果表明，oxLDL诱导人脐静脉内皮细胞凋亡及PCSK9和LOX-1的表达，用PCSK9 siRNA预处理人脐静脉内皮细胞可阻断oxLDL的上述作用，提示PCSK9 siRNA可抑制oxLDL诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡，其中Bcl/Bax-caspase9-caspase3通路可能通过降低Bcl-2/Bax比值，抑制caspase9和caspase3的激活而发挥作用[25]。PCSK9抑制也降低了c-Jun氨基末端激酶和p38的磷酸化，后者在氧化应激、IL-1、TNF-α和G蛋白偶联受体诱导的细胞凋亡中发挥重要作用[26]。另外也有研究表示，脂多糖处理培养的平滑肌细胞可刺激PCSK9的释放，在活性氧的参与下通过p38MAPK信号通路诱导线粒体DNA的损伤，进而导致平滑肌细胞凋亡[27]。

田璐[28]等发现，AP时胰液异常释放引起的胰腺细胞内MAPK活化主要与胰腺细胞的凋亡有关。在机体受到缺氧、缺血以及炎性因子等刺激下，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之间平衡的改变导致了细胞凋亡的发生。进一步激活下游caspase-3级联反应从而诱导细胞凋亡。此外，有动物实验表明，小鼠肝脏中p38-MAPK磷酸化和caspase-3切割与AP的诱导及Fas配体的上调有关，提示蓝素诱导的AP上调肝脏中促凋亡通路，促进肝细胞损伤和肝细胞死亡[29]。朱等[30]研究显示，黄芩素可下调肺组织中p-p38MAPK和Bax表达，上调Bcl-2表达，进而改善胰腺的病理损伤。早在1999年Gomez等人便得出，多种基因在AP发生时被激活进而用于调控胰腺腺泡细胞凋亡。在脂多糖刺激之前给予p38抑制剂处理，脂多糖所致的中性粒细胞凋亡明显增强，说明抑制p38途径能调节脂多糖刺激后中性粒细胞内ERK-MAPK途径的激活，促进急性炎细胞凋亡，从而减轻对正常组织的损伤作用[31]。

3.3 PCSK9与脂质代谢

Shirya等[32]首次提出了PCSK9在转录和转录后水平驱动肠细胞合成载脂蛋白B和甘油三酯，并表示PCSK9刺激胆固醇调节元件结合蛋白1脂肪酸/甘油三酯生物合成途径中靶基因的表达，从而增加肠细胞中间密度脂蛋白的合成，这可能是PCSK9促进细胞内甘油三酯生物合成的原因之一。有研究提出血浆PCSK9和甘油三酯水平之间的正相关是间接的，PCSK9通过消耗LDLR而阻止中间密度脂蛋白和乳糜微粒残余物的代谢从而升高甘油三脂，也可能通过对其他LDLR样受体，如CD36、VLDL受体的降解来升高甘油三酯[10]。但也有研究发现应用PCSK9抑制剂并未对VLDL载脂蛋白B和VLDL甘油三酯生成有影响，但它能增加VLDL载脂蛋白B和VLDL甘油三酯的分解代谢，表明PCSK9可能并不影响甘油三脂的脂蛋白生成，而只影响其清除[33]。而且PCSK9抑制剂对甘油三酯水平的影响，不同的研究结果差异很大，甘油三酯下降范围从3.3%～33.7%不等[34]。Hitoshi等[35]指出，PCSK9除了作为肝脏LDL代谢的中介外，也与胰岛素抵抗和甘油三酯水平呈正相关，是肠道富含甘油三酯的ApoB脂蛋白代谢的重要调节因子，通过影响富含甘油三酯颗粒的LDL代谢而影响血清甘油三酯水平。PCSK9基因的功能缺失突变也将导致富含甘油三酯的脂蛋白减少，甘油三酯水平降低[36]。

高甘油三酯血症(hypertriglyceridemia，HTG)导致胰腺炎的机制目前尚不完全清楚，最早由Havel提出的一个被广泛接受的机制，即渗出到胰腺腺泡细胞外的胰脂肪酶水解胰腺内和胰腺周围的甘油三脂，导致游离脂肪酸增多引起胰腺局部缺血以及酸碱失衡，进一步增加了游离脂肪酸的细胞毒性，扩大炎症反应[37]。Saharia等[38]人的实验研究支持了这一假设，用脂肪酸灌注胰腺会导致胰腺制剂的水肿和出血，此外，在AP动物模型中，HTG已被证明有助于并加速炎症级联反应，产生大量炎性细胞因子，导致HLAP。这些研究进一步印证了HTG对胰腺的损伤，从而诱发HLAP。目前研究证实PCSK9与甘油三酯水平密切相关，因此PCSK9在HLAP的发生发展中可能发挥重要作用，有望成为HLAP相关研究的新靶点。

4 总结与展望

综上所述，PCSK9可通过NF-κB通路调控炎症反应，以及通过MAPK通路调节细胞凋亡，此外，还发现PCSK9具有参与脂代谢，调控甘油三酯水平的作用。已知HLAP的病理生理过程不仅有炎症反应和细胞凋亡的参与，而且高甘油三脂水平也参与其中，因此，PCSK9与HLAP的发生发展过程密切相关。但是相关机制是复杂的，有许多未知的病理生理机制需要去探索，需要更多的动物及临床实验进行专门的验证。鉴于上述理论和实践基础，我们将在临床上进行相关实验研究，为诊治HLAP提供新的靶点，旨在为HLAP患者带来的福音。