分光光度法对再生蛋白质纤维中蛋白质含量的测定

王亚妮，李莉萍，张阳，张敏莉

(宝鸡市质量技术检验检测中心，陕西宝鸡721013)

0 前言

再生蛋白质纤维是区分于蚕丝、羊毛等天然蛋白质纤维，利用高科技方法制造出的富含蛋白质的纤维。一般情况下，先由含有蛋白质的动植物中提炼出蛋白质溶液，然后将其与其他高聚物共同接枝或共混复合而成[1]。国外研究可追溯到19世纪60年代，而在我国，上世纪末才开始对其进行研究及开发利用。目前，再生蛋白质纤维品种繁多，比如大豆蛋白纤维、牛奶蛋白纤维、蚕蛹蛋白纤维和玉蚕蛋白纤维等，其中大部分都已经规模化生产，普遍应用于日常生活中。由于其富含蛋白质而深受消费者的青睐，蛋白质的优良特性也使得蛋白质含量成为蛋白质纤维性能的重要指标。然而，目前此类产品蛋白质含量的检测标准以及检测方法研究甚少，标准体系还不健全，消费者无法很好地了解产品性能，维护自身权益。因此，研究更优化、更准确的检测方法是目前迫切需要解决的课题。

本文把分光光度法应用于再生蛋白质纤维的蛋白质含量检测，通过对试验条件的探索，影响因素的分析，数据的对比，形成更优化、更易于推广的再生蛋白质纤维中蛋白质含量检测的试验方法。

1 方法原理

根据国家标准GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》，再生蛋白质纤维中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸生成硫酸铵，在pH为4.8的乙酸钠和乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3，5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。在波长400 nm的环境下测定其吸光度值，与标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为所含蛋白质质量分数。

2 试验部分

2.1 样品

试验样品有质量分数为100%的羊毛及蚕丝，牛奶蛋白纤维（乙烯醇基）、牛奶蛋白纤维（丙烯腈基）、大豆蛋白纤维（乙烯醇基）和蚕蛹蛋白纤维（黏胶基）。

2.2 主要试剂

硫酸铜、硫酸钾、硫酸、氢氧化钠（质量浓度300 g/L）、对硝基苯酚指示剂溶液、乙酸钠-乙酸缓冲溶液、氨氮标准使用溶液、质量分数为37%的甲醛、乙酰丙酮（以上均为分析纯）。

2.3 仪器设备

紫外分光光度计、石墨消化仪、恒温水浴锅（100±0.5）℃、天平、10 mL具塞玻璃比色管、容量瓶（100 mL、50 mL）、刻度吸管。

2.4 测试

2.4.1 样品前处理和消化

样品的前处理依据GB/T 2910.1—2009《纺织品定量化学分析第1部分：试验通则》中8.2规定的方法进行。称取一定量处理过的混匀的试样（精确至0.001 g）于消化管中，加入一定量的硫酸铜、硫酸钾和硫酸，在石墨消化仪中进行消化处理一段时间，直至液体呈蓝绿色透明状，再加热一段时间，取下冷却，慢慢加入少量的水，放冷后转移至100 mL容量瓶中，定容，在此消化过程中同时进行空白试验。

2.4.2 标准曲线绘制以及样品测定

吸取5.0 mL试样及试剂空白消化液于50 mL容量瓶内，加入1～2滴对硝基苯酚指示剂溶液，摇匀后滴加氢氧化钠溶液中和至黄色，再滴加乙酸溶液至溶液无色，用水稀释至刻度，混匀、备用。然后绘制氨氮标准曲线，同时吸取2.0 mL上述试样溶液和同量的试剂空白溶液于10 mL比色管中，加乙酸钠-乙酸缓冲溶液及显色剂，混匀，置于沸水浴中加热15 min。取出用水冷却至室温后，于波长400 nm处测量吸光度值，试样吸光度值与标准曲线比较定量或代入线性回归方程求出含量。

2.4.3 计算公式

含量测定的计算公式见式1。

式中：w——试样中蛋白质的质量分数，%；

m1——试样测定液中氮的质量，μg；

m0——试剂空白测定液中氮的质量，μg；

m——试样质量，g；

100——换算系数；

F——氮换算为蛋白质的系数。

2.5 比对方法

2.5.1 次氯酸钠法

2.5.2 凯氏定氮法

凯氏定氮法是经典的检测蛋白质含量的成熟方法，其起初是检测乳制品、食品类产品蛋白质含量最常用方法之一，后被应用到其他检测领域。凯氏定氮法试验依据FZ/T 50018—2013《蛋白黏胶纤维蛋白质含量试验方法》中方法A来测试样品中蛋白质含量，差异在于其使用全自动凯氏定氮仪法进行测试。所用仪器为Kjeltec 8200型福斯自动凯氏定氮仪。

3 结果与讨论

3.1 分光光度法测试影响因素

3.1.1 样品

再生蛋白纤维由于其特殊的成丝原理，一般选择一种基体作为依托，融合蛋白质液来纺丝，最终呈现出蛋白质和基体材料两种特性。目前成丝所用的基体大多为黏胶、聚乙烯醇和聚丙烯腈等高聚物。比如，黏胶基的蚕蛹蛋白黏胶纤维、聚丙烯腈基的牛奶蛋白纤维等。而按照分光光度法试验原理，此方法会检出样品中所有的含氮原子，对于聚丙烯腈基的牛奶蛋白纤维，此方法检出的蛋白质含量还包含了聚丙烯腈里的氮原子，最终会导致蛋白质含量检出值偏高。牛奶蛋白纤维含量测试结果见表1。

表1 牛奶蛋白纤维测试结果

表1中的牛奶蛋白纤维为两种：一种是聚丙烯腈基的牛奶蛋白纤维；另一种是乙烯醇基的牛奶蛋白纤维。前一种为质量百分比为30%的牛奶蛋白纤维和70%棉纤维的混合物，后一种为纯牛奶蛋白纤维，用3种不同的检测方法对其进行检测。结果显示，对于丙烯腈基的牛奶蛋白纤维，用分光光度计法和凯氏定氮法检出的蛋白质含量偏高；对于乙烯醇基的牛奶蛋白纤维，3种方法检测结果则无明显差异。因此，在蛋白质含量检测时，了解样品的结构以及特性是首要任务，是选择合适正确方法的前提。

3.1.2 消化时间与消化温度

本试验中，选择用石墨消化仪来消化试样，既批量化又安全且节约时间，但合适的消化温度和准确的消化时间是关键因素。依据硫酸的沸点，试验中起初选择消化温度为400℃，消化时间1 h时，观察消化液成浅黄色，消化不完全；消化温度不变，延长消化时间，不断观察直至时间为2 h时，消化液成蓝绿色并且澄清透明，消化完全。但消化液放凉后，发现存在消化液结块现象，且同一样品测定结果值差异较大。调整消化温度为420℃，随着消化时间增加，观察消化液变化，直至消化时间为1.5 h时，消化液成蓝绿色且澄清透明，消化完全，且放凉之后消化液整体呈溶液状态，同一样品测定结果值也较稳定。

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3.1.3 水浴加热温度

试验中水浴加热时间为15 min的过程中，水浴的温度对试验成功与否起决定性作用。当水浴锅的温度不能持续保持在沸腾状态时，15 min之后拿出比色管放凉，比色管里的溶液较浑浊，用分光光度计进行比色，同一样品整体数值偏高，精密度结果偏差大。但是，当水浴锅温度持续保持在沸腾状态时，加热15 min之后的比色管里溶液澄清透明，同一样品的数值稳定，精密度结果良好。所以在试验中，为了确保试验结果的准确性，一定要控制好水浴温度，必须保持在持续沸腾的状态。

3.1.4 氮换算为蛋白质系数

氮元素在所有蛋白质中含量较为稳定，约占16%[2]，分光光度法就是利用蛋白质中氮元素的含量来测蛋白质含量。所以在2.4.3中的计算公式（1）中，要乘以F（氮换算为蛋白质系数）值计算出最终的蛋白质含量。而氮换算为蛋白质的系数虽是一个常数，但在不同的物质中有所差异，比如在大豆蛋白制品中一般为6.25，在纯乳与乳制品中为6.38，这些数值参考食品标准中蛋白质的折算系数，对于再生蛋白纤维中蛋白质含量的折算是否准确不得而知。本文依据FZ/T 50018—2013《蛋白黏胶纤维蛋白质含量试验方法》中的规定，再生蛋白质纤维氮换算系数为6.25。但对于羊毛、蚕丝等蛋白质纤维，没有准确可参考的数值，本试验则是通过次氯酸钠法比较试验分析，最终得出羊毛氮换算系数为5.79、蚕丝氮换算系数为5.55。

3.2 三种方法的测试结果以及数据分析

用分光光度、凯氏定氮和次氯酸钠分别测试羊毛、蚕丝、牛奶蛋白纤维（乙烯醇基）、大豆蛋白纤维和牛奶蛋白纤维中的蛋白质含量，测试结果见表2、表3和表4。

表2 分光光度法测试结果

表3 凯氏定氮法测试结果

表4 次氯酸钠法测试结果

依据FZ/T 50018—2013《蛋白黏胶纤维蛋白质含量试验方法》中的精密度的规定（在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对值不得超过算数平均值的10%，以大于算数平均值10%的情况不超过5%为前提），分析数据的精密度，符合标准要求。同时，计算各组数据的相对标准偏差，检测结果的精密度良好。

3.3 与次氯酸钠法、凯氏定氮法比较

为了判定3种方法之间的差异性，采用F检验法单因素方差分析对3种方法的测试结果进行检验，结果见表5。

表5 分光光度法、次氯酸钠法和凯氏定氮法的比较

由表5可见，在置信区间95%下，计算出同一样品3种不同方法的P值＞0.05，这说明3种方法测试的数据无显著性差异。

4 结语

（1）分光光度法测试再生蛋白质纤维中蛋白质含量的原理实为全氮法，即检出样品中所有含氮元素的量。所以它同凯氏定氮法一样存在局限性，不适合再生蛋白质纤维基体中含有氮元素的纤维，会导致蛋白质测定结果偏高。

（2）分光光度法试验时，完全消化条件为消化温度420℃、消化时间1.5 h，试验中水浴温度持续保持在沸腾状态，加热15 min。

（3）分光光度法较之次氯酸钠法，影响测试结果的因素较少，抗干扰性小，结果较准确。次氯酸钠法受次氯酸钠浓度、溶解温度和溶解时间等条件的影响较大。

（4）与凯氏定氮法相比较，分光光度法试剂用量少，操作简单、安全环保。同时，分光光度计是每个实验室最基本的检测仪器，操作简单，对人员要求不高，此方法更适合大范围推广。