高效液相色谱法检测贡梨中甲基硫菌灵 及其代谢物多菌灵残留量

◎ 黄丹萍，熊晓辉，陈 斌，黄 宙

（1.国家轻工业食品质量监督检测南京站，江苏 南京 210009；2.南京工业大学 食品与轻工学院，江苏 南京 210009）

随着科技的进步和人们生活水平的日益提高，社会对分析研究的需求不断上升，分析检测的灵敏度和速度一直是研究者们追求的目标。液相色谱法被广泛用于食品安全质量控制，因此建立一种高灵敏度、快速、多组分和高通量的农药残留定性定量检测技术是非常必要的[1-4]。高效液相色谱法以其良好的分离效果深受检测人员的偏爱，在熟悉常规检测流程的同时也应努力寻找更加完善的实验方法，并充分掌握与利用这一技术，进而为食品质量安全检测提供高效、快速、简便的技术支持[5-7]。本研究基于实验以及数据分析，探索一种贡梨中甲基硫菌灵及其代谢物多菌灵农药残留的测定分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料

贡梨，超市采购。

1.2 试剂与仪器设备

乙腈、甲醇，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；PSA粉、无水硫酸镁、氯化钠，西陇科学股份有限公司；甲酸，天津市致远化学试剂有限公司；乙酸，天津市致远化学试剂有限公司；活性炭粉，天津市北晨方正试剂场；甲基硫菌灵[编号GBW（E）082389]、多菌灵[编号GBW（E）081407]，上海安谱。

液相色谱仪，Waters沃特世科技有限公司；离心机，上海安亭科学仪器厂；分析天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；涡旋振荡器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；氮吹仪，上海安谱科学仪器有限公司；0.22 µm微孔滤膜，上海安谱实验科技股份有限公司；2 mL一次性医用灭菌注射器，常州市康复莱医疗用品有限公司；50 mL离心管，上海安谱实验科技股份有限公司；1.5 mL进样小瓶，上海安谱实验科技股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 溶液配制

（1）甲基硫菌灵和多菌灵混合标准储备液 （100 mg·L-1）配制。准确称量甲基硫菌灵和多菌灵标准品各10 mg，用乙腈溶解并稀释至100 mL，振荡摇匀，制备成质量浓度为100 mg·L-1的标准储备溶液。

（2）甲基硫菌灵和多菌灵混合标准工作溶液 （10 mg·L-1）配制。吸取1 mL浓度为100 mg·L-1的甲基硫菌灵和多菌灵混合标准储备溶液，用乙腈稀释至100 mL，制备成10 mg·L-1的甲基硫菌灵和多菌灵混合标准工作液。

（3）混合基质标准工作溶液（1 mg·L-1）配制。吸取甲基硫菌灵和多菌灵标准工作溶液，以乙腈为稀释液，配 制成质量浓度为0.2 µg·kg-1、0.5 µg·kg-1、 1.0 µg·kg-1、10.0 µg·kg-1、20.0 µg·kg-1和50.0 µg·kg-1的混合基质标准工作溶液。

（4）甲基硫菌灵和多菌灵混合标准使用溶液 （10 µg·L-1）配制。吸取1 mL浓度为1 mg·L-1的甲基硫菌灵和多菌灵混合标准储备溶液，用乙腈稀释至100 mL。

1.3.2 样品前处理

（1）试样制备。将样品每个个体按中轴线分成四等分，取相对的两份，放入匀浆机中制成匀浆，无需去皮。制成匀浆后的样品，放入已贴有样品标签的容器中，待测。

（2）提取。准确称取试样5 g，置于50 mL离心管中，加20 mL水，使用超声仪加热提取20 min，置室温冷却5 min后，再加入10 mL 1%冰乙酸-乙腈试剂，涡旋2 min，然后在样品溶液中加入1 g氯化钠和4 g无水硫酸镁，涡旋2 min，以10 000 r·min-1离心 5 min，静置，上清液等待净化。

（3）净化。使用移液枪准确吸取1 mL上清液，转移到装有55 mg PSA粉末、55 mg C18粉末的2 mL聚丙烯离心管中，涡旋均质1 min，以10 000 r·min-1的速度离心5 min，然后用无菌注射器吸取上清液 0.5 mL，过微孔滤膜（0.22 µm），用于上机测定。

1.3.3 液相色谱参数条件

聚苯乙烯柱：C18，7.8×100 mm，10 µm；流动相：甲醇∶水（体积比）=7∶3；进样量：10 µL；柱温：35 ℃；流速：0.4 mL·min-1；梯度洗脱。

2 结果与分析

2.1 方法优化

2.1.1 液相色谱条件的优化

转移2 mL甲基硫菌灵和多菌灵混合标准使用溶液于进样小瓶中，通过液相色谱仪检测，结果见表1，流动相及梯度洗脱条件见表2。

表1 多反应检测条件表

表2 流动相及梯度洗脱条件表

2.1.2 提取溶剂的优化

乙腈较丙酮和甲醇提取效率更好，适当加入乙酸后的提取效率更高，因此本实验选择超纯水和1%冰乙酸-乙腈作为本次提取溶剂。

2.1.3 提取溶剂用量的优化

分 别 用5 mL、10 mL、20 mL、30 mL和40 mL的1%冰乙酸-乙腈提取经过超纯水初步处理的含一定量标准物质的贡梨样品，测定其回收率。结果表明，提取液体积为5 mL时，回收率为54.5%～83.2%；提取液体积为10 mL时，回收率为72.6%～94.1%；提取液体积为20 mL时，回收率为73.1%～99.7%；提取液体积为30 mL时，回收率为74.8%～99.9%；提取液体积为40 mL时，回收率为75.2%～101.6%。综合效率和节约试剂两方面考虑，选用提取溶剂用量 为10 mL。

2.2 方法的线性范围、检出限和定量限

甲基硫菌灵和多菌灵在浓度0.2～50.0 µg·kg-1呈良 好的线性关系，甲基硫菌灵线性方程为Y=-8 150+27 000X， 相关系数R2=0.999 8；多菌灵线性方程为Y=3 970+34 400X， 相关系数R2=0.999 9。采用低浓度标准品加入法，甲基硫菌灵加标后样品含量为0.1 mg·kg-1，对应的信噪比为693，计算得到检出限为0.000 4 mg·kg-1，定量限为0.001 4 mg·kg-1。

2.3 回收率及精密度实验

实验选择加标浓度为100 µg·kg-1、500 µg·kg-1、 2 200 µg·kg-1的甲基硫菌灵标准品，测定贡梨样品中甲基硫菌灵回收率；另选择加标浓度为26 µg·kg-1、 500 µg·kg-1、2 000 µg·kg-1的多菌灵标准品，测定贡梨样品中的多菌灵回收率。甲基硫菌灵以及多菌灵的回收率的测定结果分别见表3、表4。由表3、表4可知，甲基硫菌灵以及多菌灵的回收率分别为90.5%～103.4%和92.0%～101.6%。甲基硫菌灵的平均回收率为93.3%～100.2%，相对标准偏差为1.8%～2.4%；多菌灵的平均回收率为94.5%～99.1%，相对标准偏差为1.9%～2.9%。甲基硫菌灵和多菌灵的平均回收率和相对标准偏差均达到国家标准。

表3 甲基硫菌灵回收率测定结果和精密度结果表（n=6）

表4 多菌灵回收率测定结果和精密度结果表（n=6）

3 结论

本文确定以1%冰乙酸-乙腈为提取剂，氯化钠和无水硫酸镁辅助水相和有机相分离，使用QuEChERs的方法（C18粉末、PSA粉末、无水硫酸镁混合）净化上清液，外标法定量，借助高效液相色谱仪对样品中甲基硫菌灵及其代谢物多菌灵农药残留量进行研究。结果表明，甲基硫菌灵及其代谢物多菌灵的线性关系良好，相关系数、检出限范围、定量限范围、平均回收率和相对标准偏差均达到了GB/T 27404—2008的要求。按照本研究方法，实际检测样品的甲基硫菌灵及其代谢物多菌灵农药残留量检出率和超标率为0，说明甲基硫菌灵及其代谢物多菌灵在贡梨中的使用是安全的。