除硫菌剂的工业化生产条件研究与应用

杨 帆，孟章进，姜桂英，钱志鸿，王志明

(1.中国石化江苏油田分公司工程技术研究院，江苏 扬州，225009；2:江苏省油气微生物工程研究中心，江苏 扬州，225009)

微生物人工培养和自然条件下的生理特性有很大的不同，影响合成代谢产物能力的因素也有相当大的差异，其中培养基对微生物的各种代谢活动的影响最为显著［1-2］，培养基的成分对菌体生长繁殖、产物的生物合成、产品的分离及产品质量和产量都有重要影响，除此之外，温度、pH 值、装液量等操作条件也是影响微生物生长的因素［3-4］。因此，微生物培养条件的优化非常重要。N411 是一株高温除硫菌，为提高该菌的培养效能，提高发酵水平，从温度、pH 值、摇瓶装液量3 个因素着手，开展了工业发酵培养基和发酵条件研究。

1 材料与方法

1.1 发酵培养基优化

按照表1 的组成成分设计发酵培养基，比较不同配方条件下N411菌株的生长增殖情况，以确定合适发酵生产的培养基。

表1 发酵配方设计 g

1.2 检测方法

比浊法:取一定量摇瓶液，稀释不同倍数后，用紫外分光光度计测定波长为600 nm 的吸收值（OD600）。

平板菌落计数法:取摇瓶液1 mL，分别稀释至10～5、10～6、10～8倍（由预试验得出），取0.1 mL的稀释菌液涂布于固体培养基平板上，培养1 d 后，计算摇瓶液中的活菌数。

细菌数（CFU/mL）=平板上菌落数×稀释倍数／平板上加菌液的量（mL）。

pH 检测:定期取样，以4.0～9.0 精密pH 试纸检测。

2 结果与分析

2.1 除硫菌的发酵培养基优化研究

2.1.1 发酵培养基碳源筛选

以XSN 为基本氮源，保持质量浓度10 g/L 和其他基础培养基成分配比不变，分别设置2 g/L PTT、3 g/L YMF、1 g/L PTT +1.5 g/L YMF 作为不同碳源处理，调节培养基最终pH 为7.0，50℃培养并观察菌体生长情况，明确不同碳源条件下除硫菌N411 的增殖影响。

以YMF 作为多糖部分或全部替代PTT 测定除硫菌N411 对多糖的分解利用能力（图1）。试验结果表明，2 g/L PTT 作为碳源培养条件下菌体生长较好，50℃培养16 h后菌体达最大浓度，1 g/L PTT+3 g/L YMF 的细菌繁殖量明显低于20 g/L PTT 处理。以5 g/L YMF 替代PTT 的培养基中除硫菌N411繁殖速度慢，12 h 达最大高峰期，表明除硫菌N411 能有效利用PTT等单糖作为碳源，而对DF为碳源的多糖降解利用能力较弱，在试验浓度范围内，菌体增殖能力与培养基PTT浓度成正相关。

图1 不同碳源培养基对除硫菌N411发酵培养的影响

2.1.2 发酵培养基氮源筛选

以PTT 为基本碳源，保持质量浓度2 g/L 和其他基础培养基成分配比不变，分别设置4 g/L XSN、6 g/L 豆饼粉、2 g/L XSN+3 g/L 豆饼粉等不同氮源处理，调节培养基最终pH 为7.0，50℃培养并观察菌体生长情况，明确不同氮源条件下除硫菌N411 的增殖影响（图2）。

图2 不同氮源培养基对除硫菌N411发酵培养的影响

在以2 g/L PTT 为碳源的基础培养基中，以豆饼粉作为氮源部分或全部替代无机氮NaNO3，测定除硫菌N411 对有机氮的利用能力。试验结果表明，4 g/L XSN作为氮源培养条件下菌体生长较好，50℃培养16 h 后菌体达最大浓度。2 g/L XSN+3 g/L 豆饼粉的处理中，细菌繁殖量明显低于4 g/L XSN的氮源处理，且培养16 h 后菌体自溶，浊度下降。以6 g/L豆饼粉替代XSN作为氮源的培养基中，除硫菌N411几乎不能繁殖生长，表明除硫菌N411 能有效利用XSN 等无机氮作为氮源，而对蛋白质为主要成分的豆饼粉作为有机氮源几乎不能利用。在试验浓度范围内，菌体繁殖生长与XSN浓度成正相关。

2.1.3 发酵培养基优化

在明确除硫菌N411 适宜碳源、氮源基础上，通过调整培养基中碳、氮比例对基础培养基进行优化（见表1）。

培养基各组成成分的变化直接影响了除硫菌N411 的菌体生长。基础培养基以PTT、XSN 为基本碳、氮源，能提供菌体发酵培养的一般需求，但发酵周期短，生长不整齐，16 h达最大OD600值，镜检呈现芽孢、孕孢及营养体多种菌体形态。通过对基础培养基配方调整试验表明，XSN 和PTT 是影响除硫菌发酵培养的关键营养因子，其含量和比例直接影响了菌体的发酵水平和发酵周期。在试验范围内，菌体生长量与XSN 含量成显著正相关，同时PTT 含量也显著影响除硫菌的生长。试验结果表明配方1、配方2 都能获得较高菌数的发酵培养液，培养44 h平板测定单位活菌数分别达6.6×107CFU/mL和2.1×107CFU/mL，可以在此范围内优化发酵培养基以提高除硫菌N411的发酵水平。

图3 除硫菌N411在不同组成培养基中的生长繁殖动态

2.2 除硫菌的发酵培养控制条件研究

2.2.1 不同温度条件对除硫菌生长发育的影响

不同温度条件试验结果表明，除硫菌N411 的生长对温度具有较高的要求，以50～60℃为宜。试验在40℃条件下培养24 h，孢子几乎不萌发。在60℃条件下培养孢子萌发率最高，平均达236 CFU/皿，随温度的提高，孢子萌发率有所下降（图4）。从菌落生长速度来看，萌芽的菌体随温度的升高生长速度加快，以60℃温度培养单菌落最多，说明60℃更适合菌体生长（图5）。

图4 不同温度对除硫菌的孢子萌发的影响

图5 不同温度对除硫的菌落生长影响

2.2.2 不同pH值对除硫菌孢子萌发的影响

将培养基以1 mol/L HCl 或NaOH 调节pH 值分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5 和8.0 等不同酸碱度，按照方法接入1 mL 稀释的孢子悬浮液，置于60℃生化培养箱中观察培养，24 h 检查培养基平板表面形成的菌落数，明确不同pH 条件对除硫菌N411孢子萌发的影响。

不同pH条件显著影响除硫菌N411的孢子萌发（F=46.861，P=0.000）。pH 为4.0 的酸性条件下，孢子萌发受到显著抑制，培养24 h 几乎不萌发。在酸性条件下随着pH 值的升高，孢子萌发率逐步提高，pH 值中性（pH 7.0）条件下达最大值，单位菌落数达237 个。碱性条件同样抑制芽孢的萌发，pH 值大于8.0 以上孢子60℃培养24 h 几乎不萌发。说明除硫菌适合在中性条件下生长（图6）。

图6 培养基不同pH值对除硫菌芽孢萌发的影响

2.2.3 不同装液量对除硫菌生长状况的影响

在50 mL 的灭菌的培养基中加入1 mL 除硫菌孢子悬浮液并充分摇匀。分别取4 mL、8 mL、12 mL加入15 mL 的指形管中，每处理重复6 次。以硅胶塞封口后，置于60℃、230 r/min 的摇床上震荡培养。间隔4 h 分别取出不用装液量的试管1 支，测定OD600值、pH值，并显微镜染色观察细菌生长状况。

不同装液量直接影响了培养基中的溶氧浓度，进而影响好氧微生物的生长。装液少，液体与空气接触面积大，溶氧量增加，反之则溶氧量减少。试验结果表明，除硫菌N411 在不同溶氧条件下都能繁殖生长，但溶氧量的大小影响到菌体的生长速度，充足的溶氧量有利于芽孢的形成。4 mL/管装液量生长发育速度快，整齐度高，12 h 达菌体最高浓度，OD600值达0.281，伴随着芽孢形成，pH 逐渐上升，24 h 大部分芽孢脱落完成生长周期。随装液量的增加，菌体生长速度减缓，发育进度加长，12 mL/管装液量24 h菌体形态仍处于营养体阶段，pH值为7.0，未见芽孢形成（表2）。

表2 不同装液量摇菌试验对除硫菌N411菌体生长发育的影响

2.3 除硫菌工业发酵过程控制研究

2.3.1 除硫菌的发酵周期及菌体形态观察

除硫菌在配方1 的培养基中，按照控制参数培养，24 h 完成发酵周期。接种后4 h，孢子萌发产生营养体并进行对数生长；接种后8 h 菌数显著增多，处于对数生长后期，以营养体形态存在；接种12 h后细菌在营养体一端开始形成孢囊；接种后16 h，形成孢囊的菌体自溶并释放出芽孢，20 h 后大部分芽孢脱落并聚集；24 h 后反应体系中主要以芽孢形式存在，脱落的芽孢二次萌芽生长（图7）。

图7 除硫菌N411在8M3发酵体系中菌体生长发育形态

终止培养取样测定OD600值达2.327，显著高于对照0.396 的OD600值，平板活菌数测定结果表明工业发酵生产的除硫菌N411 菌数达2.2×108CFU/mL（图8）。

图8 工业发酵除硫菌活菌数测定

2.3.2 除硫菌发酵过程pH值变化

伴随着发酵过程进行，N411 反应体系的pH 值也随之变化。接种时培养基pH 值为7.0，孢子萌发进入营养生长阶段，培养4 h 后取样检测pH 值下降至6.5。随着溶氧增加、蛋白质代谢增强，pH 逐步提高，接种后12 h pH 值升高到7.2。16 h后pH 上升至7.5，营养体形态的菌体开始形成孢囊，伴随着细胞自溶，芽孢释放，反应体系pH值上升为7.7（图11）。

图11 除硫菌N411在发酵培养过程中pH的动态变化

3 结论

（1）培养基的优化研究结果表明，在碳源选择上，除硫菌N411 能有效利用PTT 等单糖作为碳源，而对DF 为碳源的多糖降解利用能力较弱。在氮源选择上，除硫菌N411 能有效利用XSN 等无机氮作为氮源，而蛋白质为主要成分的豆饼粉作为有机氮源几乎不能利用。

（2）N411 发酵控制条件以温度、pH、装液量（溶氧）为主要参数。通过实验确定温度为60℃，pH 值为7.0，装液量为26.7%。

（3）采用制定的发酵工艺和控制条件完成了除硫菌N411 的工业发酵生产。所得发酵产品平板活菌数达2.2×108CFU/mL，且菌体整齐度高，无杂菌。