PTC-T542乳粉中沙门氏菌检测能力验证 结果与分析

◎ 马小筱

（广州市番禺质量技术监督检测所，广东 广州 511400）

沙门氏菌（Salmonellaspp.）是一种常见的人畜共患病原菌，对人类和动物都有极大危害。食物传播是人类感染沙门氏菌的主要途径，尤其是近年来，方便快餐、快熟食品、冷冻食品的盛行，在增加沙门氏菌污染可能性的同时也加大了沙门氏菌检出的难度，因此通过参加能力验证来提高检测人员素质，增加检验经验，准确分离出沙门氏菌，找出污染源，降低感染此病菌的潜在危险。

1 材料与方法

1.1 样品的来源

大连海关技术中心PTC—T542乳粉中沙门氏菌能力验证样品：冻干粉PTC213和PTC221；沙门氏标准菌株。伤寒沙门氏（FSCC215009(CMCC(B)50071)）标准菌株，将此伤寒沙门氏标准菌复苏后用瓷珠保存于-18 ℃冰箱，此标准菌株的本实验室编号为WB1，本次实验取一株编号为WB1的标准菌珠进行复苏做阳性对照实验用（实验编号为：WB1-2A）。

1.2 仪器与试剂

缓冲蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB）、亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）、沙门氏显色培养基、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂（XLD）和沙门氏菌干制生化鉴定试剂盒，以上试剂均来自广州陆桥；沙门氏菌O多价血清（A-F）（宁波天润，批号20210101）；生化培养箱；生物安全柜等。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理与预增菌

本次能力验证样品为采用西林瓶包装的冻干粉，来样编号分别为PTC213、PTC221。根据指导书说明，用75%的灭菌酒精棉球擦试西林瓶外包装，小心开启西林瓶，先用3 mL灭好菌的0.85%的生理盐水对西林瓶中的干粉进行水化，待溶解后，吸出放入无菌瓶中，用生理盐水反复冲洗西林瓶，共收集清洗液25 mL，加入225 mL BPW，进行预增菌。同时取一株本实验室标准储存菌珠进行复苏，同步进行实验，作阳性对照。将以上测试样品轻轻摇匀分别标注为PTC213、PTC221、WB1-2A，置于（36±1）℃的培养箱中，预增菌8～18 h，8 h后每隔1 h观察增菌液的变化，并分别在8 h、12 h、16 h、18 h分别进行一次增菌培养及后续实验，从分离在选择性培养基上的目标菌生长性情况来看，前增菌16～18 h的结果比较理想，接下来的实验结果均取自前增菌18 h的缓冲液作为最终结果。

1.3.2 选择性增菌

轻摇盛装编号为PTC213，PTC221及WB1-2A BPW缓冲液的三角瓶，分别吸1 mL培养混合物加入10 mL SC和10 mL TTB中，将SC置于（36±1）℃的 培 养 箱；TTB置于（42±1）℃培养 箱，培 养（18～24）h。培养24 h菌液均有轻微的浑浊现象。

1.3.3 划线分离

分别用3 mm的接种环取一环SC的培养物分别划线于一个BS平板和一个沙门氏显色平板和一个XLD平板；TTB中的培养物做同样操作。置于（36±1）℃培养箱，BS平板培养40～48 h，沙门氏显色平板和XLD平板培养18～24 h。结果如表1及图1所示。

表1 选择性增菌液SC中分离在各平板上的菌落形态表

图1 沙门氏菌典型菌落在各选择性培养基上的图示

1.3.4 纯培养及生化实验

（1）挑取PTC213选择性培养基上①②③（图1 图片中序号）所描述的典型菌落3个分别接种三糖铁（生化反应现象如图2示）及营养琼脂做纯培养，（36±1）℃培养18～24 h，挑24 h内新鲜纯培养的菌落做相应的生化实验和血清学鉴定（生化实验按陆桥干制生化鉴定试剂盒操作说明书进行操作）。

（2）对PTC221选择性培养基上Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ所描述的典型菌落及WB1-2A标准菌株同步进行如（1）中试验操作。结果描述如表2、图2；各生化反应结果列举如表3所示。

2 结果与分析

由以上实验得出结果如表2、图2所示，结合表3 生化反应现象，依照《食品安全国家标准 食品微生物检验 沙门氏菌检验》（GB 4789.4—2016）[1]中表2、 表3得 出：PTC221+BPW+SC-PTC-Ⅰ号 为A3型可疑沙门氏，依照国标ONPG的生化反应应为阴性，本实验得出ONPG为阳性，血清实验为自凝菌落，可判为非沙；依照GB4789.4—2016表2可得出PTC221+BPW+SC-PTC-Ⅲ和PTC213+BPW+TTB—③为非沙；PTC213+BPW+TTB－①/②及WB1-2A标准菌株生化反应现象完全符合典型沙门氏生化现象，结合血清学鉴定判定为沙门氏检出。

表2 可疑菌落在三糖铁上呈现的结果表

图2 可疑菌落在三糖铁上呈现的图示

表3 生化现象及结果判定表

3 要点分析

3.1 关于预增菌和增菌

随着现代方便食品的盛行，食品加工工艺也随之变化，而食品加工过程中的加热、干燥、冷冻、机械处理等加工工艺使得沙门氏菌细胞膜遭到了不同程度的损伤，使其处于比较弱的活性或濒死状态，缓冲蛋白胨水（BPW）具有较高的pH缓冲体系且为非选择性培养基，有助于修复受损的细胞膜，还能复苏处于冷冻休眠状态的细菌，但同时其他杂菌也同样得到修复与生长，杂菌太多往往会掩盖住目标菌，因此控制好预增菌的时间是非常关键的一个程序。

选择性增菌液会促进相应种群的沙门氏菌生长，同时抑制其他菌落的生长，而目前已知的沙门氏菌血清分型已有2 500多种[2]，因此沙门氏菌选择性增菌液最好多选择几种增菌液进行增菌，本文按国标 GB 4789.4—2016中的方法分别选择TTB和SC两种增菌液进行增菌，本次能力验证试验中编号为PTC213的样品，自SC增菌液中分离在3种选择性培养基上均无菌落生长，自TTB增菌液中分离在沙门氏显色及XLD培养基上均有典型菌落生长。如果本次实验只选择一种增菌液进行增菌，就会造成沙门氏漏检的可能性。SC比较适合伤寒沙门氏菌的生长，而对其他沙门氏菌具有抑制的作用。从本实验结果来看，本实验室标准储备菌株在SC中生长良好，三糖铁上表现为不发酵糖不产气，产少量的硫化氢，符合典型的伤寒沙门氏菌生化反应特征，而本次能力验证试验PTC213检出沙门氏菌虽然生化反应与典型沙门氏菌生化完全吻合，但是其在BS上完全不生长，周正等[3]研究用鼠伤寒沙门氏和伤寒水氏在BS上均生长良好，另外其在三糖铁上有大量的H2S产出，由此可以排除编号PTC213检出沙门氏菌为非鼠伤寒沙门氏、非伤寒沙门氏，具体哪种沙门氏菌还需要进一步研究。

3.2 关于生化实验

（1）关于商品化生化配套试剂盒。本实验室连续10年均采用广州陆桥的生化试剂盒作为生化鉴定的方法，从验证实验结果来看，目前还比较满意，需要注意以下4点。①菌悬液的浓度不要太高，太高容易引起假阳性。②由于各个生化孔是连在一起的，加液和取放均要小心，避免因加液及晃动的过程中引起试剂间的交叉污染，从而造成结果偏差。③按照说明书进行操作并注意额外添加物的添加量及培养时间。④选择纯培养24 h左右的新鲜菌苔进行生化及血清学试验，因为此时的菌落处于活跃期，生化反应最为灵敏。

（2）关于检测方法的讨论。目前对沙门氏的检验有实时荧光PCR方法、酶联免疫（ELISA）方法、人工培育等方法[4-5]。食品中的微生物需要在一定条件和一定的机制下产生肠毒素或是代谢产物或是其繁殖生长到一定的量才能引起人或动物的中毒或疾病，这就要求这些病菌具有一定的活性，人工培育的方法检测的准确率是目前各方法中最好的，但需要检测人员具有丰富的经验，而目前PCR及ELISA方法已经得到较好的发展，但对实验室环境要求较高，对基础实验来说实现的难度也比较大，因而在有关致病菌检测研究的文章中称经典的细菌培养方法是致病菌检测的金标准[4]。

3.3 关于菌体抗原的要点分析

GB 4789.4—2016中要求，血清学分型为选做项目本次试验不做考究，对沙门氏血清鉴定中的菌体抗原：首先排除自凝现象，再进行相应的血清抗原实验[6]。

（1）O多价抗原。多数沙门为O抗原，在O多价血清中有明显的沙粒状凝集现象，如果O多价不凝也不能轻易放弃，尤其选择性培养基典型菌落特征明显，生化现象也符合的情况下，此时需排除是否因荚膜的原因导致O多价不凝，可将菌苔接种在高琼脂含量的培养基（2%～5%），反复进行试验，目的因菌株在高琼脂含量的培养基上，荚膜发育不良，这样反复培养就可以破坏其荚膜，暴露其菌体抗原，本次试验PTC213+BPW+TTB－①号菌就是这种情况，在接种3%琼脂含量的培养基做二次纯培养后，O多价血清出现了明显的凝集现象。

（2）Vi抗原的排除。Vi抗原又称表面抗原，目前已知的存在Vi抗原的沙门氏有伤寒、丙型副伤寒、都柏林沙门氏菌[7]。当Vi抗原存在于细菌表面，阻止了O多价血清的凝聚时，应挑取菌苔于1 mL的生理盐水中制成浓度高的菌悬液，在沸水中煮沸 10～60 min后，再进行O多价血清凝聚实验。

（3）多价H抗原。H抗原又称鞭毛抗原，大部分沙门氏都周身鞭毛，H抗原发育不良会造成H抗原血清不凝集，国标中采用接种菌体至半固体中做纯培育，使鞭毛生长良好后再进行H抗原的试验，由于血平板营养更丰富，本人通过多次试验发现点种哥伦比亚血平板的方法，其鞭毛生长更加迅速旺盛，试验效果更好。