免疫检查点抑制剂的新辅助免疫治疗在肌层浸润性膀胱癌中的研究进展

梁玉杰，郭园园，刘贝贝，梅志杰，刘建民

(蚌埠医学院第一附属医院泌尿外科，安徽 蚌埠 233000)

膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，其病理类型以尿路上皮癌(Urothelial Carcinoma of the Bladder，UCB)为主[1]，其中，70%患者为非肌层浸润性(non-muscle invasive bladder cancer, NMIBC)，30%患者为肌层浸润性(muscle invasive bladder cancer, MIBC)[2]，而NMIBC可进一步发展为MIBC，后者发生转移是膀胱癌患者死亡的主要原因。目前，新辅助化疗联合根治性膀胱切除术已成为Stage II/ⅢA期肌层浸润性膀胱癌的推荐治疗方式，与术后辅助化疗相同，新辅助仍采用以铂类为基础的化疗方案[3]。近年来，免疫检查点PD-1(programmed death-1，PD-1)/PD-L1(programmed death ligand-1，PD-L1)抑制剂凭借其显著疗效优势已被批准用于转移性MIBC的治疗。除此之外，新辅助免疫治疗在多种恶性肿瘤中表现出良好疗效，这为免疫治疗作为新辅助治疗方式应用于MIBC患者提供了借鉴和可能。本文对新辅助免疫治疗在MIBC中的应用现状做一综述，旨在为MIBC新辅助治疗方式的改进提供参考。

1 免疫检查点抑制剂作用机制

免疫系统是人体九大系统之一，在外界刺激作用下，机体免疫系统被激活并启动一系列免疫反应，为阻止因过度免疫反应而造成细胞损伤，免疫细胞同时通过活化免疫抑制信号维持机体免疫动态平衡。肿瘤细胞即通过表达免疫抑制分子受体并与免疫细胞作用阻止T细胞攻击，发生免疫逃逸。近年来，PD-1/PD-L1和CTLA-4是目前证实参与免疫逃逸的重要免疫检查点分子，相关抑制剂已被应用于临床治疗多种恶性肿瘤并取得良好疗效。除此之外，基于基因工程技术的嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(chimeric antigen receptor T-cell inmunotherapy, CAR-T)的应用已从血液系统肿瘤治疗向实体瘤治疗领域扩展，在膀胱癌方面的应用目前也在临床研究阶段。

T细胞抗肿瘤治疗需要抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)接受肿瘤细胞抗原后释放第一信号，激活T细胞启动杀伤肿瘤细胞作用。除此之外，APC细胞和T细胞表面的共刺激分子提供第二信号增强T细胞的活化和杀伤作用。PD-1/PD-L1是目前肿瘤治疗中应用最广泛的免疫检查点通路。PD-1是CD28家族成员，属于免疫球蛋白基因超家族成员，主要表达于活化的T细胞、B细胞和髓系细胞。PD-L1是PD-1配体之一，可表达于肿瘤细胞和部分免疫细胞，肿瘤细胞PD-L1通过与PD-1结合抑制T细胞免疫杀伤作用，可见，PD-1/PD-L1抗体和抑制剂主要作用在T细胞效应阶段，患者可获得持久的抗肿瘤免疫反应。CTLA-4是免疫共刺激分子受体CD28的结构同系物，在T细胞受体(T cell receptor, TCR)结合APC细胞MHC分子活化T细胞的同时，竞争性抑制CD28与CD80/CD86结合，下调辅助T细胞活性并且增强Tregs细胞的免疫抑制作用。因此，与PD-1/PD-L1抑制剂不同，CTLA-4抑制剂主要作用于免疫反应的诱导阶段，阻止CTLA-4与共刺激分子CD80/CD86结合，增强T细胞活化。

2 新辅助免疫治疗在恶性肿瘤中的探索

随着多个临床研究展现出良好的疗效，免疫治疗在晚期恶性肿瘤中的应用越来越广泛。除此之外，免疫治疗作为术前新辅助治疗的临床研究已在多个瘤种中开展，尤其在肺癌、黑色素瘤中的探索取得了初步疗效。

2.1 新辅助免疫治疗在肺癌治疗中的研究CheckMate-159和LCMC-3研究是目前新辅助免疫治疗可切除肺癌的两个经典的单臂II期临床研究。Forde等共纳入21例I-IIIa期可切除的NSCLC患者，术前给予两个周期的Nivolumab治疗后行手术治疗，评价新辅助免疫治疗的疗效和不良反应。最终20例患者肿瘤达到根治性切除，术后45%(9例)患者达到主要病理学缓解(Major pathological remission，MPR)，随访24个月的中位无病生存期为69%。虽23%患者出现免疫相关不良反应，但仅1例达到3级，且所有患者未造成手术延迟，该研究结果初步证实了Nivolumab新辅助治疗NSCLC的安全性和有效性。另一项LCMC-3研究评价了Atezolizumab新辅助治疗Ib、II和IIIa期NSCLC患者的疗效。术前给予2个周期的Atezolizumab治疗，在入组的101例患者中，90例接受了手术，77例进行了主要疗效评价，MPR率为19%。所有人群3级以上不良反应发生率为6%。以上研究说明新辅助免疫治疗初步疗效是肯定的，不良反应发生率可接受，但长期的疗效及不良反应仍需要等待最终研究结果。除了以上免疫单药新辅助治疗研究外，免疫治疗联合化疗以及双免疫药物联合新辅助治疗方式也在探索过程中，然而，目前尚未见免疫药物和靶向或化疗药物新辅助治疗的多中心、随机、对照研究结果。此外，对于免疫药物的治疗方式、剂量以及不良反应方面仍是新辅助免疫治疗探索的方向。

2.2 新辅助免疫治疗在黑色素瘤治疗中的研究Amari等[4]研究团队近期在23例临床III期或低转移负荷的IV期黑色素瘤患者中比较了单药和双药联合新辅助免疫治疗的疗效。单药组给予Nivolumab 3 mg/kg 每两周一次，联合用药组给予Ipilimumab 3 mg/kg和 Nivolumab 1 mg/kg 每3周1次。结果显示联合治疗组患者病理完全缓解率达到45%，明显高于单药治疗组(25%)，但联合治疗组患者不良反应(73%)较单用Nivolumab(8%)发生率较高，也因此试验被迫中止。目前研究认为，围手术期应用单个免疫药物在可接受的安全范围内，Ipilimumab(3mg/kg)治疗黑色素瘤的1级并发症为17%，3～5级并发症发生率较低。另一项试验纳入29例IIIB、IIIC或IV期黑色素瘤患者，给予3个周期的单剂量Pembrolizumab治疗后手术切除病灶，继续辅助治疗1年，其中大约30%的患者达到病理完全缓解，且24个月维持无复发生存状态。尽管新辅助免疫治疗在黑色素瘤患者中的疗效得到肯定，但对于最佳治疗方案仍有待更多研究数据提供参考。

2.3 新辅助免疫治疗在其他恶性肿瘤中的应用除肺癌和和黑色素瘤外，新辅助免疫治疗在其他多个恶性肿瘤中的研究也在如火如荼的进行中，如胶质瘤、乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌以及肾癌等。Timothy等[5]对35名胶质母细胞瘤患者进行意向性治疗分析，16名患者被随机分入新辅助Pembrolizumab组，其余19名患者被分入辅助组。辅助治疗组3名患者术前退出，两组各1名患者因术后胶质母细胞瘤的组织学证据不足被剔除。至分析截止日期为止，新辅助组有9例患者死亡而辅助组有12例患者死亡，新辅助患者总体存活率显著增加。辅助组患者中位总生存期为228 d，而新辅助组患者中位总生存期为417 d。辅助组患者中位无进展生存期为72.5 d，新辅助组为99.5 d。GeparNuevo团队[6]评估了原发性三阴性乳腺癌患者在标准新辅助化疗(NACT)基础上联合Durvalumab的有效性和安全性。患者被随机分入Durvalumab组或安慰剂组，在紫杉醇应用前2周单独给予Durvalumab或安慰剂治疗，Durvalumab组患者病理完全缓解率为53.4%，安慰剂组为44.2%，且不良反应发生率在可接受范围内。可见，联合应用化疗和免疫药物新辅助治疗三阴性乳腺癌可明显提高患者受益。除此之外，新辅助免疫治疗在局部进展性头颈部鳞状细胞癌(NCT02919683、NCT02488759)和肾细胞癌(NCT02595918、NCT02575222、NCT03055013、NCT02446860)中的多项研究同样在进行中，期待达到预期疗效。

3 免疫治疗在肌层浸润性膀胱癌中的应用

免疫治疗首先在尿路上皮癌治疗中取得了突破性进展，几项有关CTLA-4/PD-1/PD-L1抗体的重要研究肯定了其单药治疗的疗效Ipilimuma是完全人工合成的IgG1单抗，拮抗CTLA-4，在尿路上皮癌中首先作为新辅助疗法研究，具有重要的免疫性药效学影响。一项Ipilimuma联合GC化疗一线治疗转移性尿路上皮癌的Ⅱ期多中心临床研究结果显示，ORR为69%，1年的OS为61%，联合Ipilimuma治疗后提高了22%的患者治疗反应，较既往的研究疗效有所提高。

Atezolizumab是一种人源性PD-L1免疫球蛋白G(IgG)1抗体，可阻断PD-1结合。I期试验证明Atezolizumab在转移性尿路上皮癌患者中有持久的活性，特别是在肿瘤浸润性免疫细胞中PD-L1高表达的患者中。随后的多中心单臂II期研究报告了Atezolizumab治疗铂类化疗失败后转移性尿路上皮癌患者的临床疗效[7]。在这项研究中，315名不能手术的局部晚期或转移性尿路上皮癌患者在铂类基础化疗后病情进展。所有患者的客观有效率均为15%。所有患者的中位总生存期为7.9个月。在最近的一项II期试验中，Atezolizumab还显示出作为一线治疗不符合顺铂使用条件的局部晚期和转移性尿路上皮癌的生存益处[8]。

Pembrolizumab单抗是一种人源化的单克隆IgG4 PD-1抗体，在一项多中心单臂II期研究中，370名以前没有接受过系统化疗的晚期尿路上皮癌患者被招募接受至少一剂Pembrolizumab单抗治疗，这些患者不符合顺铂标准。24%的患者有客观反应[9]。在另一项开放随机III期试验中，542名晚期尿路上皮癌患者在以铂为基础的化疗后复发或进展，被分配Pembrolizumab治疗或选择紫杉醇，多西紫杉醇，或长春花碱化疗。Pembrolizumab组总生存期的中位数为10.3个月，而化疗组仅为7.4月(P=0.002)。

Nivolumab是一种PD-1 IgG4抗体，一项多中心、单臂、2期试验Nivolumab在铂类药物治疗后转移性尿路上皮癌的研究(CHECKMATE 275)[10]，270名患者接受了nivolumab治疗，其中265人接受了活性评估。中位生存期为7.00个月。265例患者中52例获得了满意的客观疗效。其中PD-L1表达≥5%的81例患者中有23例，PD-L1表达≥1%的122例患者中有29例，PD-L1表达<1%的143例患者中有23例。

Durvalumab是一种选择性的人IgG1单克隆抗体，可以阻断PD-L1与PD-1和CD80的结合，评估Durvalumab单抗安全性和抗肿瘤活性的1/2期剂量升级和剂量扩展研究报告称，所有患者的初始总应答率为31.0%[11]。一项Durvalumab(10 mg/kg，每2周)治疗局部晚期或转移性UC的Ⅰ/Ⅱ期临床试验(Study 1108)[12]。入选182例患者时，ORR为17.0%，高PD-L1表达患者和低PD-L1表达患者的ORR分别为26.3%和4.1%。其中，43%的患者出现3～4级不良反应。2017年SCO年会更新的中位PFS和OS分别为1.5个月和18.2个月(n=191)[11]。

4 新辅助免疫治疗在肌层浸润性膀胱癌中研究进展

自2016年以来，已相继有五种PD-1/PD-L1抑制剂被美国FDA批准用于晚期肌层浸润性膀胱癌及术后辅助治疗，其中包括三种PD-L1抑制剂(Atezolizumab，Durvalumab、Avelumab)和两种PD-1抑制剂(Pembrolizumab、Nivolumab)。基于铂类的新辅助化疗低反应率和免疫药物在膀胱癌中的疗效，目前多个PD-1/PD-L1抑制剂已被用于肌层浸润性膀胱癌的新辅助免疫临床探索，并取得了初步疗效评估。2020年4月替雷利珠单抗成为中国首个且唯一获批尿路上皮癌PD-1/PD-L1单抗。

4.1 免疫检查点抑制剂单药的新辅助治疗研究PURE-01[12]研究共纳入50例接受根治性膀胱切除术(Radical Cystectomy,RC)的患者,临床分期分别为 cT3 27例(54%)，cT2 21例(42%)，cT2-3N1 2例(4%)。在RC前给予三个周期的Pembrolizumab 200 mg治疗，其中1名患者(2%)出现转氨酶升高并停用Pembrolizumab，所有患者均行RC，21例患者降期至pT0(42%)。27例患者降期至PT<2(54%)。在PD-L1综合阳性评分(Combined Positive Score,CPS)>10%患者中，54.3%患者RC术后病理显示pT0，而在CPS<10%的RC患者中pT0仅13.3%。在肿瘤突变负荷(TMB)和pT0之间观察到显著的非线性关联。研究表明新辅助治疗选用Pembrolizumab可使42% MIBC患者完全缓解。且当PD-L1阳性或高肿瘤突变负荷(TMB)的患者时，效果更佳。同时也证明Pembrolizumab可能是治疗MIBC的一种有价值的新辅助疗法。

Briganti等[13]评价了连续68例患者接受三个周期新辅助Pembrolizumab治疗后，根治性膀胱切除术和盆腔淋巴结清扫的手术安全性。CT3bN0M0 MIBC参加了PURE-01试验。在第二次分析中，将研究期间在同一机构接受NAC治疗的41名患者的结果与围手术期结果进行了比较。与接受新辅助免疫治疗的患者相比，接受化疗的患者具有更高的临床和病理分期。虽然90 d时并发症和再住院率没有差异，但接受培溴利珠单抗治疗的患者与接受化疗的患者相比，失血量和输血率较低。结果显示了新辅助 Pembrolizumab 治疗的安全性，对随后的根治性手术几乎无影响。

在ABACUS[14]研究中，共纳入74例T2-4N0M0的患者，在手术前给于2周期Atezolizumab新辅助治疗(1200 mg Q3),结果15例患者只进行了1周期的治疗。在最后取得病理标本的68名患者中(67例膀胱切除术，1例术前肿瘤进展)表现为pCR的患者20例，39%患者降期为NMIBC。纳入患者中PD-L1高表达组40%患者表现为pCR，而低表达组pCR患者仅为16%，结果提示Atezolizumab在膀胱癌新辅助免疫治疗中发挥重要作用。

4.2 免疫检查点抑制剂与其他新辅助治疗联合应用(1)免疫检查点抑制剂联合铂类为基础的化疗新辅助治疗方案：在一项单臂多中心II期临床研究中，选择2018年2月至2019年6月期间共41例临床分期为T2-4aN0-1M0可进行RC的膀胱癌患者，术前接受以顺铂为基础的化疗联合Nivolumab新辅助治疗。患者每周期第1天使用70 mg/m2顺铂及1000 mg/m2吉西他滨化疗，第8天予1000 mg/m2吉西他滨及Nivolumab 360 mg静滴治疗。完成四个周期治疗后的8周内行根治性膀胱切除术。其中肿瘤分期降期至非肌肉浸润状态的有27例患者，其中14例(51.8%)降至pT0，2例(7.4%)降至pT1，5例(18.5%)降至pTa，pCR率为49%(20/41)，但该实验中PD-L1阳性状态与缓解之间没有相关性。15例PD-L1阳性肿瘤患者中有10例(67%)出现肿瘤缩小，而24例PD-L1阴性肿瘤患者中有17例(71%)出现肿瘤缩小。结果证明顺铂与Nivolumab新辅助治疗可使MIBC患者病理分期明显降低，且安全可靠。但由于研究时间过短，患者进展和生存数据仍未达到研究终点。(2)免疫检查点抑制剂联合放疗新辅助治疗方案：在一项前瞻性单臂多中心II期试验(RACE IT)中[15]，将组织学确认为局部晚期膀胱癌(cT3/4，cN0/N+)患者并且不符合新辅助顺铂化疗条件或拒绝新辅助化疗的患者纳入研究并接受Nivolumab 240 mg静脉注射。术前每2周1次，共4个周期，同时进行膀胱和盆腔区域放射治疗(最大50.4Gy)。在11～15周之间进行根治性膀胱切除术和标准化的双侧盆腔淋巴结清扫术。目前该实验仍然处于招募受试者阶段。

5 免疫治疗疗效评价指标

新辅助免疫治疗在肌层浸润性膀胱癌的应用虽初见成效，但是部分不敏感患者行新辅助治疗有可能延误病情、错过手术时机、导致疾病迅速恶化。因此，通过检测相关疗效预测指标选择合适的患者进行新辅助免疫治疗显得尤为重要。

5.1 PD-L1表达率现今，已有多项研究表明PD-L1表达率与免疫检查点抑制剂疗效正相关，Garon等[16]评价Pembrolizumab对非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)的疗效，发现PD-L1阳性患者客观缓解率(ORR)显著延长。Ketnote024研究为Pembrolizumab单药一线治疗PD-L1阳性表达大于50%且EGFR(epidermal growth factor receptor)野生型、间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)阴性的晚期NSCLC患者的Ⅲ期临床试验，结果显示PD-L1高表达患者的疗效全面优于化疗。另一项Keynote 研究结果显示Pembroliumab单药一线治疗,与常规化疗相比,显著延长PD-L1≥1%且不伴EGFR及ALK突变患者的总生存时间。Keynote 181研究表明中经过一线治疗后，PD-L1联合阳性评分(CPS)≥10%的转移性食管癌患者使用Pembroliumab比使用化疗患者OS显著延长。鉴于以上研究结果，高PD-L1表达是对免疫检查点抑制剂治疗有益，但在NSCLC及多个癌种包括胃癌、肾细胞癌、尿路上皮癌等研究中亦发现，PD-L1低表达或不表达的患者也能从抗PD-L1治疗中获益，因此，目前免疫抑制剂在多个恶性肿瘤中的应用并未限制于PD-1/PD-L1阳性患者，但阳性患者对于药物的反应率和患者疗效可能更加肯定。

5.2 肿瘤突变负荷(Tumor Mutational Burden，TMB)肿瘤突变负荷是每百万碱基中被检测出的体细胞基因编码错误、碱基替换、基因插入或缺失错误的总数，为反映基因突变频率高低的指标。研究显示免疫检查点抑制剂的反应与驱动突变没有显著相关性，但总体突变负荷可能会影响免疫检查点抑制剂的疗效[17]。IMvigor 210临床试验结果显示有治疗反应(CR/PR)的转移性尿路上皮癌患者较无反应的转移性尿路上皮癌患者有更高的TMB。PURE-01研究进一步表明当转移性膀胱尿路上皮癌患者TMB>15 mut/Mb，会具有更高的病理完全缓解率。CheckMate-032研究Nivolumab 单药与Nivolumab联合Ipilimumab治疗晚期小细胞肺癌(Small cell lung cancer,SCLC)患者的疗效，结果示两组中高TMB患者较低TMB患者疗效均更好。虽然这些实验都证明TMB是推荐免疫治疗的标志物之一，但由于TMB检测无统一标准和价格昂贵等因素，致使TMB在临床应用中受限。

5.3 微卫星不稳定(Microsatellite instability，MSI)肿瘤细胞突变包括DNA复制和错配修复突变。DNA错配修复是通过修正错配的碱基进行修复，碱基错配主要来源于DNA复制中的错误。修复过程主要由相应蛋白复合物完成，其中包括MLH1、MSH2、MSH6等。DNA错配修复的缺失导致微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)。MSI的存在，表明错配修复(mismatch repair，MMR)蛋白的突变，DNA错配修复缺失导致新抗原出现并引发了免疫监视，进而提高了免疫检查点抑制剂的响应。Le等发现MMR蛋白失活的大肠癌患者对Pembrolizumab治疗的临床反应有所改善。同样，POLE和POLD基因(编码DNA聚合酶(POLE)和delta 1(POLD 1)的基因对于DNA复制中的校对和保真度具有重要的作用，它们的体细胞突变可导致DNA修复缺陷以及致癌)突变的NSCLC患者也表现出对Pembrolizumab治疗的客观临床反应。因此，临床医生可以根据患者的DNA错配修复能力来确定患者是否可以从免疫治疗中受益。2017年5月，FDA批准默克公司Pembrolizumab用于治疗所有MSI-H/dMMR实体瘤。通过评价PD-1抑制剂在12种不同类型MMR严重缺陷癌症中的应用效果证实大约53%肿瘤患者表现出客观影像学反应，21%患者表现为完全反应和持久反应，中位无进展生存期延长[18]。基于该结果，针对存在MSI-H/dMMR改变的患者应用免疫检查点抑制剂已达成基本共识，但根据不同基因突变进行具体的分子分型指导精准免疫靶向治疗的分子基础有待进一步充实。

5.4 肿瘤微环境(Tumor microenvironment，TME)和肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor-infiltrating lymphocyte，TIL)抗肿瘤免疫过程本质上是肿瘤与免疫系统的相互作用，不仅与肿瘤细胞本身特性有关，还与肿瘤微环境中间质细胞功能相关。目前认为肿瘤微环境中TIL对于许多实体肿瘤预后和治疗反应的预测价值最大，TIL浸润程度较大的患者更容易从免疫治疗中获益。Galon等研究表明，CD3和CD8阳性的结直肠癌患者表现出明显的高OS率。另一项研究显示CD8阳性率高的黑色素瘤患者多表现PD-L1高表达，免疫抑制剂可明显改善这部分患者的生存预后并延迟脑转移时间[19]。除此之外，大肠癌、黑色素瘤或非小细胞肺癌患者的生存期延长与肿瘤活检样本中淋巴细胞的浸润有关[20]。此外，也有研究表明CD8+T细胞在Pembrolizumab治疗有反应和无反应的黑色素瘤患者中表达差别不大，TIL浸润数量不太可能成为预测免疫治疗临床效果的独立生物标志物。然而，尽管TIL作为预测免疫治疗疗效的独立因素等有待证实，但其在肿瘤免疫治疗中的作用前景是较为乐观的，值得深入探讨。

6 展望与小结

新辅助化疗联合根治性膀胱全切术已成为肌层浸润性膀胱癌的一线治疗方案，但以铂类为基础的化疗反应率较低，疗效与预期仍有差距。免疫检查点抑制剂已被批准用于晚期浸润性膀胱癌，且新辅助免疫治疗临床试验结果令人鼓舞，有望取代新辅助化疗，打破膀胱癌治疗方式局限的瓶颈，但这仍需要更多的实验数据支持。除此之外，新辅助免疫治疗是静脉应用还是膀胱内注射，膀胱内注射检查点抑制剂是否比静脉注射更有效和安全以及新辅助免疫治疗联合放化疗是否增加疗效等问题也是该领域探讨的焦点。