循环肿瘤细胞在结直肠癌预后及疗效评价中的研究进展

张昶 韩超 黄南祺 吴小兵 徐学虎

在全球范围内，结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是第三大常见癌症和第四大癌症相关死亡病因［1］。我国的CRC 综合发病率和死亡率分别排第三位和第五位，且总体仍呈上升趋势［2］。研究显示，结直肠癌在诊断时已有约1/4 患者发生远处转移，接受治疗的患者中仍有约一半发生转移［3］。目前，结直肠镜与组织病理学检查由于侵入性高，难以为患者提供精准的预后信息［4］。结直肠癌的疗效评价主要以影像学检查RECIST1.1 为标准，但由于费用高及滞后性等因素影响，实用性并不高；癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）等血清肿瘤标志物检测结果也仅用于参考［5］。循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）是因各种原因脱离原发实体肿瘤，进入血液并游离其中的肿瘤细胞。CTCs 可在靶器官增殖并形成转移灶，导致远处器官的继发性肿瘤，故CTCs 与肿瘤的血行转移紧密相连。CTCs 的基本检测方法为从患者的体液样本中获取生物标志物，又被称为“液体活检”［6］，其中外周血最为常见。与传统组织病理学检查相比，CTCs 检测具有微创、易于重复、取材简单等优点，可发现早期难以发现的微转移［7］。目前CTCs 已被美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准用于监测乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌的疾病进展以及临床评估患者的预后与治疗疗效［8］。本文就CTCs 在结直肠癌的预后评估与疗效评价中的临床应用现状作一综述。

1 CTCs 检测与富集技术

1.1 标记依赖性检测技术

CTCs 检测和分离最广泛使用的方法是基于免疫亲和力的检测。由于CTCs 不同程度表达上皮细胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）和细胞角蛋白（cytokeratin，CK）等上皮标志物，上皮标志物抗体可与磁性纳米颗粒偶联或修饰在微流控芯片的沟道上，通过阳性或阴性富集策略进行CTCs 捕获［9］。标记依赖性检测技术的代表性平台之一是CellSearch 系统，它使用EpCAM 包被的纳米磁珠来选择EpCAM 阳性的细胞，再通过免疫染色确认CK8、18 的高表达和CD45 的不表达的CTCs［10］。Cohen 等［11］利用Cell⁃Search 系统检测了430 例转移性结直肠癌（meta⁃static colorectal cancer，mCRC）患者外周血中CTCs 数量，得出CTCs 数量是影响mCRC 患者无进展生存期（progression⁃free survival，PFS）和总生存期（overall survival，OS）的独立因素。AdnaTest平台（AdnaGen AG，Langenhagen，德国）则依赖于抗体混合物包被的磁珠，以增强结直肠癌中CTCs的捕获和富集；再通过多重反转录⁃聚合酶链反应技 术（reverse transcription⁃polymerase chain reac⁃tion，RT⁃PCR）检测各种基因（如HER⁃2、MUC⁃1和KRAS）的突变［12］。该平台通过结合两种方法来提高CTCs 检测的灵敏度以及更好的异质性表征。CellMax 检测平台是一种基于微流控芯片技术的单一特异性的EpCAM 依赖性检测方法，可从外周血中准确富集CTCs。Tsai 等［13］通过CellMax平台将捕获的CTCs 计数与不同CRC 分期（腺瘤，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期）相关联，结果在各阶段均显示出高特异性（86%），验证了其作为早期癌症检测方法的可靠性。

1.2 基于CTCs 物理特性的检测技术

CTCs 的细胞分析显示，与正常细胞相比，CTCs 的生物物理特性表现出明显不同。它们具有更大的核浆比、更大的尺寸、不同的核形态，以及与正常细胞不同的电学特性［14］。物理法可不依赖表面标记物富集到更多子类的CTCs，具有广阔前景。ISET（RareCells Diagnostics，Paris，法国）是利用CTCs 细胞大小及其细胞结构的刚性特性进行分离富集的平台，其主要优势在于灵敏度高，所需血液标本量少，可在不破坏细胞形态的基础上分离上皮细胞［15］。OncoQuick（Greiner Bio⁃One International GmbH，Frickenhausen，德国）和Ficoll⁃Paque（GE Healthcare Life Sciences，Uppsala，瑞典）是基于沉降系数的差异来分离CTCs 的典型密度梯度离心方法。与Ficoll 相比，OncoQuick分离纯度高，CTCs 捕获率也有一定提升［16］。近年来，基于CTCs 大小原理的微流控芯片也被开发出来，被称为“三维过滤”。Parsortix 系统是将微流控芯片构建为3D 几何形状，并通过宽度逐渐减小的阶梯样结构以捕获CTCs 的技术平台。该平台对于不同来源肿瘤细胞的捕获率为42%～70%，且捕捉的CTCs 活性率达到了99%［17］。最近，Su 等［18］根据CTCs 与正常血细胞间大小与变形能力的差异，研发出一种新的集成微流控装置用于CRC 患者外周血CTCs 的分离，结果显示在3 小时内所有晚期CRC 患者的外周血样本中均成功捕获到CTCs。

2 CTCs 在CRC 预后评估中临床价值

CTCs 作为一种潜在微转移灶，其在外周血中的存在与肿瘤患者的死亡结局密切相关［19］。有研究报道，对CTCs 数量及其动态变化过程进行监测可预测肿瘤患者的预后，与TNM 分期联合应用则可更精确地预测患者预后［20］。许多研究也表明，CTCs 对非转移性和转移性CRC 预后的评估均具有极高价值。对于非转移性CRC，CTCs 可预测未来的转移和较差的疾病预后；而在mCRC 患者样本中鉴定出CTCs 则可能表明转移病灶的形成［21］。Bork 等［22］研究发现CTCs 计数及手术前后CTCs 的动态变化可预测非转移性CRC 的预后，而术前CTCs 检测更是非转移性CRC 一个有力的独立预后标志物。在Cohen 等［11］针对430 例mCRC患者的研究中，≥3 个CTCs/7.5 mL 与PFS 和OS 缩短相关；而在化疗治疗5 周内，基线CTCs 计数从≥3 转变为<3 则与较长的PFS 和OS 相关。另一研究则发现在基线CEA≥25 ng/mL 的患者中，基线CTCs<3 的患者OS 更长；而在治疗后CEA 降低相似的患者中，CTCs 水平不同的患者也表现出差异较大的预后［23］。这表明CTCs 与CEA 的联合检测可更精准地评估预后。

CTCs 各亚型的预后价值也有所差异。有报道称，上皮⁃间质转化（epithelial⁃mesenchymal tran⁃sition，EMT）过程与肿瘤的侵袭与转移紧密相连，导致上皮标志物表达下调，使基于EPCAM 的CTCs 检测技术易出现假阴性结果［24］。Kozuka等［25］对mCRC 患者CTCs 样本于单细胞水平进行RNA 测序，结果显示EMT 型CTCs 比上皮CTCs更常被检测到，且与mCRC 患者的不良预后相关。CTCs 也可用于针对原发肿瘤病灶的基因检测，进而评估CRC 患者的预后。Denis 等［26］通过微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）对35 名CRC 患者的CTCs 样本进行KRAS基因状态检测，结果发现CTCs 与相应肿瘤组织间的一致性为77%，敏感性为83%。这一数据表明，从CRC 患者的血液样本中检测CTCs 中KRAS 突变可用于预测原发肿瘤中的突变，从而改善患者预后。另有研究报道，侵袭性CTCs 大多表达CD133、CD44 和CD54+，CD133+、CD44+、CD54+的CTCs 高表达意味着更短的生存期及更差的预后［27］。综上，相关研究充分体现出CTCs 在结直肠癌中不同层面的预后价值。

3 CTCs 在CRC 疗效评价中临床价值

3.1 CTCs 在非转移性CRC 中的疗效评估

对于非转移性CRC 患者，手术是行之有效的首选治疗手段，术前检测到的CTCs 正是影响癌症进展和生存的有效预后因素［28］；同时，手术操作也会影响外周血CTCs 数量。Wind 等［29］研究显示，与术前相比，术中CTCs 的检出率和数量显著增加，且开腹手术检测到的CTCs 明显多于腹腔镜手术。有报道显示，接受原发肿瘤手术切除的CRC患者术后外周血中CTCs 数量会明显减少，表明手术已发挥治疗作用；反之，高CTCs 水平则表明术后的转移风险增加［30］，术后持续存在CTCs 也与患者的无复发生存期（relapse⁃free survival，RFS）缩短和预后不良密切相关［31］。Yang 等［32］通过研究138 例行根治术CRC 患者的RFS，发现术后CTCs 阳性是预后不良的独立指标，且与术前CTCs 阳性无关。最近也有研究表明，当非转移性CRC 患者的术后CTCs<3 或术后CTCs 数量比术前CTCs 数量减少或持平时，表现为良好预后；反之则表现为不良预后［33］。综上，CTCs 数量变化可反映非转移性CRC 患者的手术治疗效果，对手术疗效作出评价。

3.2 CTCs 在mCRC 中的疗效评估

据报道，约50%～60%的CRC 患者会发生转移，其中80%～90%的患者患有不可切除的肝脏病变［34］。近年来，mCRC 的治疗取得了显著进展，从OS 约11～12 个月发展到如今的平均OS 达到3年［35］。不过，mCRC 的高度异质性依旧阻碍着靶向治疗策略和个体化治疗方案的优选，临床上需要预后标志物来监测化疗反应，对mCRC 患者的化疗疗效进行评价。Cohen 等［11］首次报道了CTCs 计数可作为患者预后的指标以及评估mCRC患者化疗疗效的标志物，目前已被FDA 批准用于临床实践。此外也有报道称，CTCs 是mCRC 患者PFS 和OS 的独立预测因素，也是一线治疗有效性评估的关键因素［36］。

目前，CEA 是监测mCRC 对全身治疗反应的首选标志物。然而，Sørbye 等［37］的研究指出，在接受含奥沙利铂化疗治疗的CRC 患者中尽管出现了客观缓解，而CEA 水平却一过性升高，这一现象说明了CEA 作为疗效评价标志物的不稳定 性。Satoshi 等［38］通过一项基于64 名接受奥沙利铂治疗的mCRC 患者的前瞻性研究发现，相较于CEA，CTCs 水平并未出现激增，表明在监测mCRC 对全身治疗的反应方面，CTCs 是比CEA更有效的标志物。由于CTCs 通过提前识别潜在转移，确定患者对化疗是否耐药进而评估化疗疗效，故在化疗过程中，CTCs 持续存在提示肿瘤对化疗不敏感，若检测到CTCs 在化疗过程中持续变化则提示肿瘤对化疗敏感。Tan 等［39］通过研究mCRC 化疗过程中CTCs 和CTCs 相关miRNAs 的变化情况，发现CTCs 与miRNA 联合时可更好地反映疗效及疾病进展状况。此外，Javier 等［40］研究发现CTCs<3/7.5 mL 的KRAS野生型肿瘤患者的PFS 和OS 均高于CTCs>3/7.5 mL 的KRAS突变型肿瘤患者，CTCs 计数和KRAS状态是接受贝伐单抗化疗治疗的mCRC 患者的独立预后因素。这些研究表明，CTCs 与其它靶点或生物标志物的联合检测在mCRC 患者疗效评价方面显示出巨大的应用潜力。

4 小结与展望

通过近些年研究的不断深入，CTCs 检测作为新型液体活检技术已应用于多种肿瘤领域，其相关技术在不断进步，应用领域也在持续扩大。与传统影像学检查和组织病理学检查相比，CTCs 检测具有微创、快速等优势，在肿瘤性疾病的早期诊断、疗效评价及预后评估等方面都具有巨大潜能。但是，CTCs 的临床转化与应用依旧面临着诸多挑战，如检测技术缺陷、检测结果的假阳性率与假阴性、缺乏关于CTCs 标准方面的共识等。在结直肠癌疗效及预后评估方面，目前研究已表明CRC 患者外周血CTCs 数量与肿瘤的复发转移密切相关，基于CTCs 水平的动态监测也是预后及疗效评价有价值的临床工具。将CTCs 与CEA等生物标志物同时检测，可多层面地提高CRC 患者疗效评价的精确性。虽然目前还面临着样本量不够大、检测手段缺陷等导致的可靠性不足的问题，但随着本领域研究者的不断拓展，如针对CRC 特性进行多次多时间点CTCs 检测、与多生物标志物及基因位点联合检测等，CTCs 在结直肠癌患者治疗及预后评价中的重要性将会充分得到体现。