胚胎植入前地中海贫血检测试剂评价

曲守方 黄传峰 李丽莉 黄杰

地中海贫血（简称地贫）是一种常见的常染色体单基因遗传病，α⁃地贫和β⁃地贫是最常见的地贫类型［1⁃2］。它是目前我国南方地区在胚胎植入前遗传学检测（preimplantation genetic testing，PGT）领域中数量最多的单基因遗传病之一。胚胎植入前遗传病检测技术包括跨跃断裂点PCR（Gap⁃PCR）、短串联重复序列（Short Tandem Repeats，STR）连锁分析、单核苷酸多态性（Single⁃nucleotide polymorphisms，SNPs）分析和高通量测序（Next Generation Sequencing，NGS）等方法［3⁃5］。NGS 已经成为临床上用于胚胎植入前染色体非整倍体、染色体结构异常和单基因病检测的主要检测手段之一［6⁃8］。为使胚胎植入前遗传学诊断（preimplanta⁃tion genetic diagnosis，PGD）和胚胎植入前遗传学筛查更加规范并能够有效地实施，我国专家制定了胚胎植入前遗传学诊断/筛查技术专家共识［9］。

目前国内已有公司开发胚胎植入前地中海贫血检测试剂盒（半导体测序法），它是通过连锁分析判断胚胎是否遗传了来自父母的地中海贫血基因突变。本研究使用胚胎植入前地中海贫血诊断国家参考品，评价基于半导体测序法的胚胎植入前地中海贫血检测试剂盒的性能。

1 材料与方法

1.1 样本

胚胎植入前地中海贫血诊断国家参考品，包括4 个家系样本，中国食品药品检定研究院（简称中检院）提供。

1.2 试剂与仪器

胚胎植入前地中海贫血检测试剂盒（半导体测序法）和测序反应通用试剂盒（半导体测序法），苏州贝康医疗器械有限公司。

Qubit 4.0 荧光定量仪，美国Life Technology 公司；7500 实时荧光定量PCR 仪，Applied Biosystems公司；DA8600 基因测序仪，广州市达瑞生物技术股份有限公司。

1.3 国家参考品检测

按照试剂盒的说明书进行操作，取家系样本中的胚胎细胞样本进行细胞裂解后，然后等温扩增。将扩增后的胚胎细胞基因组DNA 使用Qubit荧光定量仪进行定量。取家系中其它样本和胚胎细胞的基因组DNA 作为模板，扩增选定区域，在扩增后的DNA 片段两端加上通用的测序接头，构建测序文库。使用7500 实时荧光定量PCR 仪，对文库进行定量。根据文库的定量结果，取等物质的量的文库进行混合。根据测序反应通用试剂盒（半导体测序法）操作说明书，混合文库使用DA8600 基因测序仪进行测序。将下机数据使用胚胎植入前遗传病检测分析软件进行数据分析。

2 结果

2.1 国家参考品1 号家系

胚胎CNGB030013 的β 珠蛋白基因（hemo⁃globin beta gene，HBB）基因检测结果：单体型结果为M1/F2（即遗传CNGB030012 女方风险染色体中国型δβ，CNGB030011 男方正常染色体βN）；其致病基因检测结果为中国型δβ/βN。HBA基因的检测结果：单倍体结果为M2/F1（即遗传CNGB030012 女方正常染色体αα，CNGB030011男方风险染色体α⁃3.7），其致病基因检测结果为αα/α⁃3.7。见表1。HBB基因中SNP 位置5192095⁃5248243 的SNP 位点处于中国型δβ 缺失所在区域，SNP 位置5247992 的SNP 位点为CD41⁃42 突变位点所在区域。见表2。HBA基因中SNP 位置224619 和224647 的SNP 位点处于α⁃3.7缺失所在区域。见表3。

表1 国家参考品1 号家系结果Table 1 The result of national reference materials for family No.1

表2 HBB 基因连锁分析结果Table 2 The result of HBB gene linkage analysis

表3 HBA 基因连锁分析结果Table 3 The result of HBA gene linkage analysis

2.2 国家参考品2 号家系

胚胎CNGB030017 的α 珠蛋白基因（α⁃globin genes，HBA）基因检测结果：单体型结果为M1/F2（即遗传CNGB030016 女方风险染色体ααCS，CNGB030015 男方正常染色体αα）；其致病基因检测结果为ααCS/αα。见表4。HBA基因中SNP 位置221057⁃234632 的SNP 位点处 于⁃⁃SEA缺失所在区域，SNP 位置223597 的SNP 位点处于CS 突变位点所在区域。见表5。

表4 国家参考品2 号家系结果Table 4 The result of national reference materials for family No.2

表5 HBA 基因连锁分析结果Table 5 The result of HBA gene linkage analysis

2.3 国家参考品3 号家

胚胎CNGB030021 的HBB基因检测结果：单体型结果为M2/F1（即遗传CNGB030020 女方正常染色体βN，CNGB030019 男方风险染色体中国型δβ）；其致病基因检测结果为βN/中国型δβ。见表6。HBB基因中SNP 位置5214597⁃5249004 的SNP 位点处于中国型δβ 缺失所在区域，SNP 位置5247992 的SNP 位点处于CD41⁃42 突变位点所在区域。见表7。

表6 国家参考品3 号家系结果Table 6 The result of national reference materials for family No.3

表7 HBB 基因连锁分析结果Table 7 The result of HBB gene linkage analysis

2.4 国家参考品4 号家系

胚胎CNGB030010 的HBB基因检测结果：单体型结果为M2/F1（即遗传CNGB030008 男方风险染色体βIVS⁃II⁃654，CNGB030009 女方正常染色体βN）；其致病基因检测结果为βN/βIVS⁃II⁃654。见表8。HBB基因中SNP 位置5247153 的SNP位点处于IVS⁃II⁃654 突变位点所在区域。见表9。

表8 国家参考品4 号家系结果Table 8 The result of national reference materials for family No.4

表9 HBB 基因连锁分析结果Table 9 The result of HBB gene linkage analysis

3 讨论

胚胎植入前单基因病遗传学检测是辅助生殖技术和分子生物学技术相结合而发展起来的一门新的诊断技术。该检测技术是通过囊胚滋养外胚层活检，取出滋养层细胞3～5 个，进行单细胞全基因组扩增，经过高通量测序及生物信息学分析后，选择不带致病基因突变的囊胚植入子宫继续妊娠，达到优生的目的。目前全基因组扩增（whole genome amplification，WGA）是通过非选择性地扩增活检的滋养外胚层细胞的整个基因组DNA，为后续分析提供足量的DNA 模板，包括简并寡核苷酸引物PCR（Degenerate oligonucleotide primer PCR，DOP⁃PCR）、多重置换扩增（multiple displace⁃ment amplification，MDA）、多次退火环状循环扩增（multiple annealing and looping⁃based amplifica⁃tion cycles，MALBAC）等［10⁃11］。全基因组DNA 扩增均匀性不够，将降低覆盖率和分辨率，并增加等位基因脱扣的几率；扩增精确性不够，则将导致大量假阳性结果［12］，可通过单体型连锁分析技术可有效提高检测准确性。注：M1 表示女方风险染色体，M2 表示女方正常染色体；F1 表示南方风险染色体，F2 表示男方正常染色体。

胚胎植入前地中海贫血检测若直接对胚胎地贫致病位点进行检测具有一定的局限性，只针对部分已知的位点进行检测，无法覆盖所有地贫的类型。同时在单细胞扩增过程中易发生目标区域丢失或者等位基因脱扣的情况，导致检测失败或造成假阳性、假阴性结果。胚胎植入前地中海贫血检测试剂盒（半导体测序法）是对α⁃地中海贫血相关基因HBA1、HBA2和β⁃地中海贫血相关基因HBB及其上下游连锁的SNP 位点进行检测。根据先证者子代1 的两条链分别来自父亲和母亲各一条链，构建出单体型，然后根据胚胎的有效SNP 位点信息，判断胚胎的基因型。胚胎中至少存在一个有效位点为杂合的基因型，才能构建出单体型。为了避免由于DNA 重组导致假阳性或者假阴性，设计试剂盒时需要包含尽可能多的高频突变的SNP 位点，从而在样本中检出尽可能多的有效位点。

中国食品药品检定研究院建立胚胎植入前地中海贫血诊断国家参考品，用于胚胎植入前的胚胎HBA和HBB基因突变检测试剂盒的性能评价，适用方法学有高通量测序法、gap⁃PCR 法、一代测序法和芯片法。本研究结果显示国家参考品4 个家系样本的检测结果均与标示结果一致，未出现漏检、假阳性或假阴性结果。评价的试剂盒能够准确检测出国家参考品的相应基因型别。研究表明研制的国家参考品能够满足胚胎植入前地中海贫血检测试剂盒质量评价的要求。